日本对虾c型溶菌酶的高效重组表达及产物分析

从日本对虾(Marsupenaeus japonicus)血液中提取总RNA,根据GenBank已登录的该cDNA序列(AB080238),通过RT-PCR技术扩增出日本对虾溶菌酶(MjLys)成熟肽基因。该基因完整的开放阅读框为477 bp,编码158个氨基酸(aa),前18 aa为信号肽,成熟肽由140 aa组成,分子量为16.4 kD,理论等电点(pI)为8.80。经分析表明,该基因含有一个完整的c型溶菌酶结构域(1-130 aa),包括c型溶菌酶特有的两个活性中心Glu33和Asp50,以及8个保守结构Cys残基。将MjLys成熟肽基因亚克隆至原核表达载体pET-32a(+),在大肠杆菌细胞BL21(DE3)pLysS中诱导发酵,实现了重组MjLys蛋白的高效表达,并测定了该重组蛋白对几种细菌的抑菌活性。结果表明,重组日本对虾溶菌酶对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌和溶壁微球菌均有显著的溶菌活性。     

对虾PjCaspase基因启动子的克隆及其特征的初步分析

对虾是最重要的海水养殖产品之一,但是自从20世纪90年代以来,一直受到病害的严重威胁,尤其是对虾白斑综合症病毒(White spot syndrome virus,WSSV),已成为危害对虾养殖的最主要病原[1]。但因对虾等海洋无脊椎动物的免疫系统不完善,无法用疫苗进行免疫防治[2],至今尚无有效的防治药物,因此滥用违禁药物现象普遍,严重影响对虾的品质。     

一种有效去除赤潮生物的粘土复合体系

以粘土为主要成分,通过添加A、B两组分制备出能有效去除赤潮生物的粘土复合体系．设计了三因子三水平正交实验,考察了该体系对锥状斯克里普藻(Scrippsiella trochoidea)、强壮前沟藻(Amphi-dinium carterae)和赤潮异弯藻(Heterosigma akashiuo)的去除率,探讨了具有较高去除赤潮生物效果的复合体系对日本对虾(Penaeus japonicus)仔虾(体长1～1．5cm)的影响．结果表明,该体系对3种赤潮生物的去除能力为：锥状斯克里普藻>强壮前沟藻>赤潮异弯藻,各因子中粘土对赤潮生物去除效果的影响最大．日本对虾仔虾急性毒性实验结果表明,96h时对照组日本对虾仔虾死亡率高达80％,加入粘土和组分A、B的Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ组死亡率均低于40％,适当浓度的组分A、B可以提高赤潮生物的去除率而对养殖生物无害,表明该复合体系具有较好的推广和应用前景．     

不同pH值条件下日本对虾肝胰腺及血的细胞培养

动物细胞培养是生物技术的一个重要领域 ,因为培养的细胞可以用来分离纯化病毒、生产疫苗和药物。本实验在日本对虾肝胰腺细胞和血细胞原代培养的基础上 ,利用RNA DNA值进行不同pH值培养基的比较 ,认为对于血细胞pH 7 2为最适值 ,而对于肝胰腺细胞pH 7 6比较合适。同时利用光镜及电镜做了一些形态和结构上的观察。     

盐度对日本囊对虾仔虾生长发育和Na+-K+-ATPase活力的影响

研究了盐度对日本囊对虾仔虾(Marsupenaeus Japonicus)的生长发育和Na -K -ATPase活力的影响。结果表明,盐度对日本囊对虾仔虾存活率、增重率和Na -K -ATPase活力的影响显著(P<0.05)。随着向低盐度变化的增加,仔虾的存活率和增重率明显下降,而向高盐度变化无显著差异;在盐度变化48h内,随着盐度变化的增加仔虾Na -K -ATPase活力变化增大,各处理组仔虾Na -K -ATPase活力随着取样时间的增加呈峰值变化,至24h时低盐度处理组酶活力达到最大值,而高盐度处理组达到最小值:至48h~72h时,不同盐度下仔虾Na -K -ATPase活力趋于稳定,而且盐度越低酶活力越大。由此表明日本囊对虾仔虾在低盐度地下卤水中的适宜盐度为20‰—24‰。     

日本对虾Bcl-2基因的cDNA克隆与抗寒功能研究

为研究B 淋巴细胞瘤-2 (B-cell lymphoma, Bcl-2) 基因在内源性细胞凋亡通路中发挥的重要调控作用, 实验利用cDNA末端快速扩增(RACE) 技术克隆获得日本对虾(Marsupenaeus japonicus)MjBcl-2 基因cDNA全长序列, 并对其序列进行生物信息学分析; 利用实时定量PCR (qPCR) 技术分析了MjBcl-2在不同组织、不同水温胁迫及RNA干扰后的表达水平; 同时利用TUNEL技术, 检测MjBcl-2 干扰后的细胞凋亡情况。结果显示: 日本对虾MjBcl-2 cDNA全长为2432 bp, 开放阅读框长度为726 bp, 共编码241个氨基酸, 分子量为26.80 kD; 结构域预测分析表明MjBcl-2 含有Bcl-2家族典型的保守结构域; 多序列比对以及进化树构建结果表明, MjBcl-2与其他物种的相似度较高, 保守性较强。定量PCR结果显示, MjBcl-2在日本对虾各个组织中均有表达, 肌肉中表达量最高, 鳃次之, 心脏中表达量最低。低温(10℃和16℃)胁迫下日本对虾鳃和肝胰腺Bcl-2基因的表达量逐渐上升, 在72h到达最高点; 在干扰Bcl-2基因后, 各个温度Bcl-2基因的表达量均下调, 细胞凋亡基因Caspase-3的表达量显著上调(P<0.05) 。TUNEL检测结果表明, RNAi组和NC组(对照组) 随着温度的降低, 凋亡细胞数量不断增加, 在28℃处理组中有少量凋亡细胞, RNAi组与NC组凋亡细胞的数量没有明显的变化, 在10℃低温处理组中, RNAi组凋亡细胞的数量明显高于NC组; 12h后, 28℃ NC组、28℃ RNAi组、10℃ NC组和10℃ RNAi组中鳃组织的细胞凋亡率分别为1.73%、2.35%、21.59%和33.70%。研究表明, MjBcl-2在日本对虾应对低温胁迫中发挥重要作用。     

成体对虾的荧光标记研究

采用平均体长为9cm的日本对虾(Penaeus japonicus)为试验动物,用蓝色、红色和绿色荧光染料(Visible Implant Elastomer,VIE)荧光标记对虾.结果表明,用VIE标记后的3个试验组的日本对虾与对照组的日本对虾在生长发育等方面没有差异,试验组和对照组在对应的周存活率基本一致,各组对虾蜕皮正常.尽管荧光标记的残留率随着日龄的增加有所下降,但荧光标记的保持率为100%.3种颜色中的红色荧光标记效果最好,蓝色最差.     

金属离子对培养日本对虾肝胰腺细胞的影响

研究了培养基中分别加入Ca^2 、Mg^2 和Zn^2 对培养日本对虾肝胰腺细胞的影响,以测定细胞的RNA／DNA值作为评价指标。当Ca^2 浓度为1g／L时,细胞生长最好;本实验中随Mg^2 浓度的增加,培养的日本对虾肝胰腺细胞的RNA／DNA值也升高;当Zn^2 浓度为80μg／L时,其RNA／DNA值最高;培养基中混合加入Ca^2 和Mg^2 有助于细胞贴壁生长。     

日本对虾(Marsupenaeys japonicus)HsP70基因cDNA的克隆与序列分析

根据中国明对虾(Fenneropenaeuschinensis)Hsp70的cDNA序列及日本对虾(Marsupenaeusjaponicus)Hsp70cDNA序列片段设计引物,用RT-PCR方法,从经热休克处理的日本对虾鳃总RNA中克隆到长1992bp的Hsp70cDNA序列,包括长1959bp的完整编码序列(CDS)。根据编码序列推导出相应的652个氨基酸,与其他真核生物Hsp70家族成员进行同源性比较,发现与凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)、斑节对虾(PinaeusmonodonFabricius)、中国明对虾(Penaeuschinesis)的相似度分别为99.5%、99.4%、99.4%,与日本沼虾(Macrobrachiumnipponense)和罗氏沼虾(M.rosenbergii)的相似度分别为93.7%和92.9%,与虹鳟(Oncorhynchusmykiss)、原鸡(Callusgallus)、家鼠(Musmusculus)和人(Homosapiens)的相似度为89.2%、85.4%、88.3%和88.3%,表现出较高的保守性。分析表明所得到的日本对虾Hsp70是一种Dnak亚家族类型的细胞质Hsp70,拥有完整的N端ATP酶结构域(约45kDa)、底物肽结合结构域(18kDa)及C端结构域(10kDa)。以上结果说明我们所得到的序列是一条包含完整CDS的Hsp70基因序列。     

日本对虾野生种群和养殖群体的同功酶遗传变异

ＰｅｎａｅｉｄｓｈｒｉｍｐＰｅｎａｅｕｓｊａｐｏｎｉｃｕｓ ,ｃｏｍｍｏｎｌｙｎａｍｅｄａｓＦｌｏｗｅｒｙＳｈｒｉｍｐｏｒＢａｎｄｅｄＳｈｒｉｍｐ ,ｉｓｏｎｅｏｆｔｈｅｍｏｓｔｃｏｍｍｅｒ ｃｉａｌｌｙｉｍｐｏｒｔａｎｔｓｐｅｃｉｅｓｏｆｍａｒｉｎｅｃｒｕｓｔａｃｅａｎｆｉｓｈｅｒｙｉｎＣｈｉｎａ .Ｂｅｉｎｇｏｆｔｈｅｗａｒｍ ｗａｔｅｒｓｐｅｃｉｅｓｃｏｎｄｕｃｔｉｎｇｓｈｏｒｔｄｉｓｔａｎｃｅｍｉｇｒａ ｔｉｏｎ,ｔｈｅａｎｉｍａｌｉｓｍａｉｎｌｙｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄｉｎｔｈｅｃｏａｓｔａｌｗａ…