蛋白质组研究新前沿：定量蛋白质组学

在过去几年里，蛋白质组研究取得了令人鼓舞的进展，2DE-MS途径的自动化，多维色谱整合串联质谱的使用，弥补了一些用双向凝胶电泳分离蛋白质的技术缺陷；从稳定同位素标记到ICAT战略的提出，为准确定量在细胞或组织中发挥重要调节功能的低丰度蛋白质提供了一个较为理想的方法。同时，蛋白质芯片技术的不断发展，也极大的丰富了定量蛋白质组学的研究。就定量蛋白质组学及其相关技术研究进展作一简要综述。  

牙鲆CA/GT微卫星标记的筛选

采用生物素选择杂交法与放射性同位素杂交法相结合的技术,成功地从牙鲆(Paralichthys olivaceus)基因组中分离出含有CA/GT重复类型的微卫星序列。通过两轮淘选,共获得526个阳性菌落。测序其中的119个菌落,结果获得133个含有微卫星座位的序列。除了两个复合型微卫星外(1.5%),完美型63个(47.37%),非完美型68个(51.13%)。设计并合成22对微卫星引物,对8个人工雌核发育家系的亲本进行遗传背景分析。PCR结果表明,4对引物无扩增带或者扩增带不是目的条带,1对引物表现为单态,其余17对引物均呈多态性,平均每个座位产生5.2个复等位基因,杂合度为0.375～0.846,多态信息含量为0.305～0.823。结果表明,所筛选的大部分微卫星标记能够用于牙鲆群体遗传学研究。  

蛋白质溶液NMR结构测定的一些新进展

新的标记技术的进展和采用稀释的液晶作为溶剂以提供额外的结构信息，提高了核磁共振技术测定蛋白质溶液三维结构的精度，扩大了分子质量测定范围.目前已经利用多维 ¹⁵N,¹³C,²H标记NMR测定了许多分子质量为30 ku左右的蛋白质溶液结构，这一上限可能还会被进一步提高.  

尼龙膜cDNA阵列的图像处理和表达量化

高密度的cDNA阵列是大规模基因组织表达谱研究的重要技术。目标细胞的cDNA样品用同位素标记时，尼龙膜cDNA阵列对杂交信号探测的灵敏度高、线性范围大，对低表达量的cDNA也能进行有效分析。但是同位素标记的杂交样点也存在易污染、易扩散和表达量取值误差大等问题。为此，首先按同位素辐射感光原理建立严格的样点理论模型，然后对样点进行精确定位、饱和补偿、干扰校正处理，实现了样点表达量的精确提取，显著提高了量化结果的重复性。  

磷蛋白组的研究技术及其进展

真核细胞中蛋白质磷酸化是一个重要事件。真核细胞利用可逆的蛋白磷酸化来控制许多细胞过程包括信号转换、基因表达、细胞周期等。磷蛋白组的研究涉及磷蛋白的分离和鉴定 ,磷酸化残基定位和定量分析。由于蛋白质磷酸化是一个动态过程 ,在细胞中磷蛋白含量低 ,磷酸化位点可变 ,且磷酸肽的质谱信号常常会受到抑制 ,所以磷蛋白的分析存在更多的困难。本文介绍了国内外在磷酸蛋白的分离鉴定及定量分析方面的研究技术以及进展情况。目前 ,质谱仍然是核心的鉴定技术 ,寻找更好富集方法是最大的挑战。定量蛋白组学是对蛋白质的差异表达进行精确的定量分析。目前还不存在一种独立的方法可以完成磷蛋白的分离、鉴定 ,以及磷酸位点的定位和定量分析。随着样品分离技术和相关仪器的发展 ,磷酸蛋白快速、准确、全面分析鉴定将能够实现。  

定量蛋白质组学中的同位素标记技术

定量蛋白质组学的目的是对复杂的混合体系中所有的蛋白质进行鉴定,并对蛋白质的量及量的变化进行准确的测定,是当前系统生物科学研究的重要内容。近年来,由于质谱技术和生物信息学的进步,定量蛋白质组学在分析蛋白质组或亚蛋白质组方面已取得了令人瞩目的成就,但其最显著的成就应该归功于稳定同位素标记技术的应用。该技术使用针对某一类蛋白具有特异性的化学探针来标记目的蛋白质或肽段,同时化学探针要求含有用以精确定量的稳定同位素信号。在此基础上,实现了对表达的蛋白质差异和翻译后修饰的蛋白质差异进行精确定量分析。综述了在定量蛋白质组学中使用的各种同位素标记技术及其应用。  

蛋白质组学研究中的新技术

随着后基因组时代的到来,蛋白质组研究日益受到密切关注。蛋白质组学的发展需要有先进的技术平台作支撑。除了蛋白质组研究中的三大核心技术-双向电泳、质谱和生物信息学技术,近几年又不断涌现出许多新技术。本文对同位素标记亲和标签、酵母双杂交、多维色谱—质谱联用等新技术作一概述。  

抗人卵巢癌单域抗体V_H 基因的克隆、表达及放射免疫显像

 为研究小分子抗体作为导向载体的作用 ,制备抗人卵巢癌单克隆抗体COC1 83B2 单域抗体(重链可变区 ,VH) ,并进行放射免疫显像 (RII) .利用PCR技术从COC1 83B2 杂交瘤细胞中扩增COC1 83B2 的VH 基因片段 ,并将其克隆入高效表达载体pTHA90中 .重组子转化大肠杆菌TOP10 ,IPTG诱导表达VH 融合蛋白 ,经改进氯化亚锡法进行锝 ( 99mTc)的标记 ,在卵巢癌裸鼠皮下瘤模型上进行RII.结果表明 :( 1 )VH 融合蛋白以包涵体形式获高效表达 ;( 2 )改进氯化亚锡法成功进行VH 融合蛋白99mTc的标记 ,标记率达 96%以上 ;( 3)用99mTc标记VH 融合蛋白进行RII,肿瘤显像早 ,图像清晰 .说明99mTc可用于小分子抗体标记 ,应用单域抗体VH 可改善RII  

丛枝菌根真菌萌发孢子利用不同氮素及外源葡萄糖对其代谢的影响

对各种含氮基质、葡萄糖和(或)根浸出液中培养的丛枝菌根真菌Glomus intraradices孢子, 在萌发过程中对不同氮素的利用及其氨基酸的生物合成进行了研究. 用稳定同位素标记及质谱仪来分析不同氮素的利用和氨基酸的生物合成. 以高效液相色谱测量氨基酸的浓度. 在缺少外源氮素的情况下, 丛枝菌根真菌孢子萌发时可以利用内部储存的含氮化合物生物合成游离氨基酸. 其中, 丝氨酸和甘氨酸是大量合成的氨基酸. 合成的氨基酸浓度在2周内随着萌发时间的增加而增加. 在有可利用的外源无机氮(铵盐、硝酸盐和尿素)和有机氮(氨基酸)时, 铵盐和尿素比硝酸盐更容易被AM真菌萌发孢子利用, 而其利用氨基酸中的氮比无机氮源慢的多. 孢子吸收同化外源无机氮, 且将其整合到游离氨基酸中, 这些新生氨基酸浓度比无外源氮添加时要高得多. 在无葡萄糖添加的硝酸盐培养液中, AM真菌孢子中积累大量天冬酰胺. 然而, 在含有葡萄糖的培养液中, 萌发孢子因葡萄糖的吸收促进了对外源氮的吸收, 产生的游离氨基酸是无葡萄糖时的5倍, 并且发现精氨酸转为含量最多的游离氨基酸. 并且, 从外源氮吸收同化的氮可以储存于精氨酸中, 随之, 精氨酸被整合到AM真菌孢子储存的蛋白质中. 此外, 根浸出原液在AM真菌孢子萌发2周后对氮的吸收作用不明显.  

放射性同位素标记测定RNA N-糖苷酶活性的新方法

核糖体失活蛋白(ribosome-inactivating protein,RIP)是一类抑制真核细胞蛋白质生物合成的毒蛋白。近几年发现,有相当一部分RIP的作用机制属于RNAN-糖苷酶(RNA NGlycosidase),如蓖麻毒蛋白A链(ricinA-chain)及一些单链RIP。它们能专一水解大鼠核糖体28 SRNA的第4324位腺苷酸的C-N糖苷键,释放一个腺嘌呤碱基,在相应的核糖Cl位上留下一个醛基。