骨形成蛋白10成熟肽在大肠杆菌中的表达纯化及活性分析

目的:以生物制备骨形成蛋白10(BMP10)为目标,研究BMP10成熟肽在大肠杆菌中的表达及活性。方法:以人源BMP10成熟肽基因为模板,PCR获得N端带有组氨酸标签(6×His)的融合基因6×His-m BMP10,构建p ET28a/m BMP10表达载体;热击转染大肠杆菌BL21(DE3)菌株,卡那霉素抗性筛选获得重组表达菌株BL21/p ET28a-6×His-m BMP10,IPTG诱导表达后利用SDS-PAGE电泳、Western印迹对蛋白进行分析;超声波破碎菌体,收集包涵体,镍柱亲和层析纯化获得电泳纯目的蛋白;透析复性后,非还原SDS-PAGE检验目标蛋白的二聚体形成;通过体外细胞实验检测蛋白活性。结果:纯化得到纯度90%以上的m BMP10,复性后二聚体得率约为40%;活性实验测得P19细胞的Smad6蛋白表达上调3倍左右。结论:通过大肠杆菌表达体系获得具有生物活性的BMP10,为后续作用机理研究奠定了实验基础。     

hPARP1酶在杆状病毒/昆虫细胞中的高表达及快速纯化

PARP1是动物细胞内的一种重要的DNA修复酶。近几年PARP1作为新型的抗癌靶点,受到广泛的关注。为了获得高活性的PARP1,首先将hPARP1基因克隆到载体pFastBacTM1中,构建转移载体pFast-hPARP1;然后转化大肠杆菌Escherichia coli DH10Bac感受态细胞中。其次,通过位点特异性转座,将hPARP1基因整合到Bacmid穿梭载体中,构建表达质粒Bacmid-hPARP1。最后,通过脂质体将表达质粒转染Sf9昆虫细胞。Western blotting和酶活测定法对hPARP1的表达和活性进行分析。采用3-氨基苯甲酰胺亲和层析柱对收获的昆虫细胞中表达的hPARP1酶进行纯化。Western blotting结果表明在昆虫细胞中hPARP1酶表达成功。经3-氨基苯甲酰胺亲和层析柱纯化后,Sf9昆虫细胞表达出的hPARP1酶的比活由0.051 nmol/(minμg)提高到了1.988 nmol/(min.μg),而且每100 mL的细胞中能够收获约3.2 mg酶。实验结果为PARP1大规模生产和应用提供了可参考利用的技术。     

新型抗体结合蛋白CBD—SPG的设计与表达

设计并表达可用于纯化IgG的新型高栽量抗体结合蛋白CBD—SPG。利用基因重组技术将纤维素结合结构域（Cellulose Binding Domain,CBD）基因插入到表达载体pET28a—SPG中,获得重组质粒pET28a—CBD—SPG,并转化大肠杆菌曰位J（DE3）。IPTG诱导CBD—SPG融合蛋白表达,并用SDS—PAGE和Westernblot对表达产物进行鉴定。重组表达质粒pET28a—CBD-SPG经双酶切及测序验证无误;表达产物经SDS．PAGE和WesternBlot分析表明融合蛋白的表观分子量约为40kD;CBD—SPG具有良好的结合纤维素和抗体的能力,晶体纤维素Avicelphl01对CBD—SPG的载量可达11．61mg／g（w／w）。成功构建并运用原核系统表达CBD-SPG;CBD—SPG在保持良好抗体结合能力的同时,更具有了结合纤维素的能力,有望成为一种新型的亲和材料。     

蚕豆β－半乳糖苷酶活性必需氨基酸残基分析

 蚕豆β－半乳糖苷酶活性必需氨基酸残基分析龚笑海,孙册（中国科学院上海生物化学研究所,上海２０００３１）化学修饰作为一种研究酶活性基团的方法,对研究糖苷酶的催化机理有其独到的优点,并已有这方面的报道．从蚕豆纯化的β－半乳糖苷酶,分子量为７０ｋＤ,由两个...     

利用CRISPR/Cas9技术构建稳定表达人白蛋白基因的中国仓鼠卵巢细胞系

通过目的基因的随机整合方式,构建得到的CHO表达细胞系,常会因为目的基因插入到染色体内不稳定区域,而在长期传代过程中出现表达不稳定的现象,这主要是由于位点效应所导致的。为了解决这个问题,现利用CRISPR/Cas9技术介导的同源重组,将目的基因直接整合于CHO细胞染色体上的稳定表达区域,以克服位点效应带来的CHO表达细胞系的长期表达不稳定。利用该技术总共获得了2株外源基因(人白蛋白基因)定点整合细胞系; Western blot结果显示,细胞上清液的产物具有人白蛋白抗原性;细胞在贴壁状态下,两株细胞系在第3、12、23、35、50代,细胞每日表达的HSA质量接近,且均维持在0. 5pg cell/d;选取一株表达细胞系,经悬浮驯化后,在批次条件培养下,第1、25、50代的悬浮细胞,在摇瓶内的表达浓度均稳定在13～14mg/L。显示了将外源基因定点整合于CHO细胞基因组内的可行性;且外源基因整合在稳定表达区域后,重组细胞系具有对外源基因长期表达的稳定性。