一种新型的琼脂糖疏水层析介质开发及其在重组乙肝表面抗原(CHO-HBsAg)分离纯化中的应用

以粒径均一的国产高交联度快速流琼脂糖为基质,采用活化、交联等步骤合成了针对分离纯化CHO-HBsAg的3C间臂的丁基琼脂糖疏水介质,通过控制丁基配基密度提高分离HBsAg的纯化倍数和回收率,获得了纯化倍数约20、HBsAg回收率约80%的介质。评估了合成介质的理化性质,流速为500cm/h时柱压力小于0.06MPa,表明介质具有较高的机械强度和良好的流动性能,介质经过酸、碱、变性剂等处理后化学性质稳定。将介质合成工艺进一步放大到2L介质/批,应用到HBsAg分离纯化的三步层析整和工艺中,结果表明,批量合成的疏水介质,HBsAg回收率与进口介质相当,HBsAg终产品纯度在95%以上,符合国家药典要求。最后考察了介质合成批次间的配基密度的可控性和单批次合成介质的重复使用性,结果表明,合成工艺和介质的重复性能满足产业化要求,这种成本低的介质有望替代目前工业生产广泛使用的进口疏水介质。     

大孔树脂吸附与反相色谱纯化恩拉霉素

恩拉霉素作为多肽类抗生素,是一种新型、安全的饲料添加剂。本文建立了一条基于大孔树脂初纯和反相色谱精制的分离纯化工艺。该工艺路线首先使用AB-8大孔树脂在0.012 mol/L盐酸溶液-甲醇(50:50,V/V)缓冲液条件下洗脱实现恩拉霉素初步纯化,再使用制备型C18反相色谱柱在0.05 mol/L磷酸二氢钠-乙腈(70:30,V/V)(p H 4.5)缓冲液洗脱下实现恩拉霉素a和b的有效分离,a、b两个组分纯度分别达到98.5%和98.0%,a和b两种有效成分的总收率为29.2%。本研究为恩拉霉素a和b两种纯品的制备以及高纯度恩拉霉素产品的生产提供了参考。     

一种新型的琼脂糖疏水层析介质开发及其在重组乙肝表面抗原（CHOHBsAg）分离纯化中的应用

以粒径均一的国产高交联度快速流琼脂糖为基质,采用活化、交联等步骤合成了针对分离纯化CHOHBsAg的3C间臂的丁基琼脂糖疏水介质,通过控制丁基配基密度提高分离HBsAg的纯化倍数和回收率,获得了纯化倍数约20、HBsAg回收率约80%的介质。评估了合成介质的理化性质,流速为500cm/h时柱压力小于0.06MPa,表明介质具有较高的机械强度和良好的流动性能,介质经过酸、碱、变性剂等处理后化学性质稳定。将介质合成工艺进一步放大到2L介质/批,应用到HBsAg分离纯化的三步层析整和工艺中,结果表明,批量合成的疏水介质,HBsAg回收率与进口介质相当, HBsAg终产品纯度在95%以上,符合国家药典要求。最后考察了介质合成批次间的配基密度的可控性和单批次合成介质的重复使用性,结果表明,合成工艺和介质的重复性能满足产业化要求,这种成本低的介质有望替代目前工业生产广泛使用的进口疏水介质。     

间臂和丁基密度对疏水层析分离纯化重组乙肝病毒表面抗原的影响

以国产高交联度的快流速琼脂糖为基质,合成了针对纯化中国仓鼠卵巢细胞表达乙肝病毒表面抗原(CHO-HBsAg)的不同间臂(3C、8C和10C)和不同配基密度的丁基疏水介质。配基密度的增加和间臂C链的延长都会增加介质的疏水性,从而影响其对CHO-HBsAg的分离效果。采用正交实验考察了配基密度、盐浓度、pH值三个影响因素对不同间臂疏水介质性能的影响。以分离CHO表达的乙肝病毒表面抗原(CHO-HBsAg)的收率和纯化倍数为主要指标。根据正交试验结果,分离效果最佳的介质间臂为8C、配基密度为22μmol/mL。该介质在硫酸铵浓度9%、pH7.0条件下,CHO-HBsAg的收率可以接近100%,纯化倍数达到60。     

乳腺生物反应器表达的重组人抗凝血酶Ⅲ的分离纯化

抗凝血酶Ⅲ(AT Ⅲ)是人体内最重要的抗凝血物质,利用转基因技术生产重组人抗凝血酶Ⅲ(rhAT Ⅲ)受到了越来越多的关注,如何有效地将rhAT Ⅲ从转基因羊奶中分离纯化出来是实现其产业化的关键所在。本研究建立了基于等电点沉淀和肝素亲和层析的纯化工艺,实现了rhAT Ⅲ的高效、快速纯化。先用等电点沉淀法,快速去除了占总蛋白50%左右的酪蛋白;然后用肝素亲和层析纯化rhAT Ⅲ,并系统考察了pH值和温度对rhAT Ⅲ稳定性的影响,以及pH值和操作条件(洗脱梯度、流速和上样量)对rhAT Ⅲ分离效果的影响。在优化的条件下,rhAT Ⅲ纯度达到99%以上,蛋白收率达到90%,活性收率约为50%。所建立的纯化工艺简单、快速,rhAT Ⅲ收率高,为今后工艺放大提供了重要的依据和参考。     

溶液环境对百日咳疫苗分离纯化的影响

针对百日咳疫苗在低盐条件下不稳定, 容易聚集而导致层析过程收率低、分离度低的难题, 实验中选择脲作为稳定剂来改善百日咳疫苗所处的溶液环境, 并采用离子交换层析和凝胶过滤层析进行百日咳疫苗的分离纯化, 通过ELISA抗原活性测定和还原性SDS-PAGE等方法研究了脲对百日咳疫苗分离纯化的影响。结果表明, 在流动相中加入 2 mol/L脲作为稳定剂, 能显著提高离子交换层析和凝胶过滤层析中的PT和FHA活性回收率、凝胶过滤层析的分离度、PT和FHA的纯度。这些结果对百日咳疫苗的分离纯化和层析工艺优化提供了重要的依据和参考。     

溶剂环境对乙肝表面抗原(HBsAg)结构的影响

HBsAg作为乙肝疫苗的主要成分,是一种病毒样颗粒,由蛋白质和脂类通过非共价键作用形成。HBsAg保持完整结构对其功能非常重要,而目前未见对其在溶液中结构变化的研究。考察了不同溶剂环境(温度、pH值、离子类型和盐浓度)对HBsAg结构的影响。实验发现,HBsAg在常温下比较稳定,但在温度超过60℃时稳定性明显下降;pH值小于4.0时引起不可逆聚集,但在pH5.0时的聚集部分可逆;不同离子对HBsAg的影响基本符合Hofmeister序列,不同之处是SO42-比F-更易引起HBsAg颗粒的聚集,在所考察的盐中,(NH4)2SO4对HBsAg有着较大的影响,0.4mol/L时就会引起HBsAg聚集,随着浓度增加,聚集现象更加严重,所以在HBsAg的疏水层析中要谨慎使用(NH4)2SO4。     

亲和介质及溶液条件对蛋白质溶液中内毒素去除的影响

生物制品中内毒素的去除是一项十分重要的工作。为了更好地去除各种生物制品中的内毒素,采用合成的多粘菌素B琼脂糖亲和介质,通过静态吸附的方法去除蛋白质溶液中的内毒素。重点考察了介质的间臂长度、配基密度以及各种溶液条件(pH值、盐种类和浓度、蛋白质种类和浓度、内毒素浓度、添加剂等)对内毒素去除率及蛋白质回收率的影响。分别采用动态浊度法和Lowry法检测内毒素含量和蛋白质浓度。结果表明该介质具有载量高、去除速度快、去除率高、可重复使用的特点。此外,配基密度、pH值、盐浓度和蛋白质特性(等电点和疏水性)对内毒素去除效果均有重要影响。在优化的条件下,血红蛋白、人血清白蛋白和溶菌酶的回收率分别达到87.2%、73.4%和97.3%,相应的内毒素去除率分别达到99.8%、97.9%和99.7%。阐明了各种因素对内毒素去除率和蛋白质回收率的影响规律,为生物制品中内毒素的高效去除提供了参考。     

乳腺生物反应器表达的重组人乳铁蛋白的分离纯化及生物活性鉴定

以国产高交联度的快流速琼脂糖为基质,合成了不同配基密度的SP(Sulfopropyl,磺酸基)离子交换介质,建立了乳腺生物反应器表达重组人乳铁蛋白(Recombinant Human Lactoferrin,rHLF)的纯化方法。以溶菌酶为模型蛋白考察了不同配基密度离子交换介质的静态和动态吸附行为,结果表明介质具有良好的吸附性能。不同配基密度离子交换介质均可纯化得到rHLF,其中,高配基密度(0.24mol/L)的离子交换介质每毫升可以处理50mL rHLF牛乳,rHLF收率为86.5%,纯度为98.5%。圆二色谱的测定结果表明纯化的rHLF二级结构与天然人乳铁蛋白一致。生物学功能实验结果表明,rHLF的铁结合与释放活性与天然人乳铁蛋白相似,浓度为5g/L的rHLF对大肠杆菌的生长具有明显的抑制作用。     

聚乙二醇伴随式离子交换层析分离重组乙肝病毒表面抗原

对由中国仓鼠卵巢细胞(CHO)表达的多聚亚基蛋白HBsAg在离子交换层析过程中容易因亚基解离而导致蛋白解聚和丧失生物活性的难题,实验中选择聚乙二醇（PEG）作为保护剂伴随式（Polyethylene Glycol-Accompanied）离子交换层析分离纯化HBsAg。实验表明,在流动相中加入1% PEG10000(W/V)作为纯化伴侣, HBsAg的回收率由55% 左右提高到80%以上,纯化倍数基本保持在12左右。对纯化产物进行SDS_PAGE分析表明,1% PEG10000的纯化伴侣伴随式离子交换层析能全部保留HBsAg的糖基化蛋白单体（27kD和30kD）,高效液相色谱联用多角度激光散射(High Performance Size Exclusion Chromatography_Multiangle Laser Light Scattering, HPSEC-MALLS )进一步分析阐明了PEG能促使HBsAg颗粒尺寸分布更均一,结构更接近天然乙肝表面抗原。