羟基化修饰对大鼠胶原热稳定性的影响研究

采用差示扫描量热仪(DSC)研究羟脯氨酸(Hyp)含量对胶原热稳定性的影响。以不同周龄BN大鼠皮肤为原料制备了胶原,分析制备胶原中Hyp的含量;采用DSC测定不同Hyp含量胶原的临界变性温度及焓变;采用圆二色光谱(CD)检测提取胶原的二级结构。结果表明,提取胶原在41.3℃发生三螺旋解聚,CD光谱分析结果表明,当样品经临界变性温度处理后,部分三螺旋结构转化为无规则线圈结构。胶原变性过程中所需热量与羟脯氨酸含量呈正相关,实验建立了胶原热变性过程中焓变与Hyp含量的关系。该研究表明胶原中脯氨酸羟基化修饰是影响胶原热稳定性的关键因素。     

胶原蛋白肽分子量对吸收过程的影响研究

利用大鼠研究脯氨酸被吸收后羟基化修饰对血液和尿液中羟脯氨酸含量的影响,在此基础上利用平均分子量分别为1 kDa、3 kDa和大于20 kDa的胶原蛋白肽考察了分子量范围对多肽吸收速率的影响。结果表明平均分子量为1 kDa和3 kDa的吸收速率高于平均分子量20 kDa的胶原蛋白肽,平均分子量1 kDa的多肽吸收速率高于平均分子量3kDa的多肽。实验借助胃炎大鼠模型考察了胃功能缺陷对不同分子量的多肽吸收速率的影响,证明了高分子量多肽由于吸收速率较低导致在血浆中Hyp浓度衰减速率较低,而低分子量多肽受胃消化过程影响较小。     

用于MALDI-TOF MS分析的毛细管层析柱制备方法研究

研究了一种用于MALDI-TOF MS分析中样品预处理毛细管亲和层析柱的制备方法。首先采用硫酸和双氧水氧化法将羟基引入到石英毛细管内表面,进一步使用氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）对毛细管进行修饰以将氨基偶联到毛细管内表面;采用1,4-丁二醇二缩水甘油醚（BDDE）将魔芋葡甘聚糖（KGM）进行活化,将活化后的KGM与毛细管上的氨基进行了偶联,在此基础上将模型蛋白（胰蛋白酶）偶联到毛细管内KGM,成功制备出毛细管亲和层析柱,考察了KGM和环氧基含量对模型蛋白偶联量及其样品预处理效果的影响。结果表明,KGM分子量是影响毛细管层析柱上蛋白偶联量的关键因素,以胰蛋白酶抑制剂为目标物结合MALDI-TOF MS对亲和层析柱的分离效果进行了评价,证明了偶联胰蛋白酶的毛细管层析柱可有效实现胰蛋白酶抑制剂的分离和浓缩。基于表面处理和KGM衍生的毛细管亲和层析柱制备技术具有可行性,并可用于MALDI-TOF MS分析的样品预处理。     

高产谷胱甘肽的酵母融合菌株的选育及其培养条件的研究

通过初筛、单倍体分离、诱变及原生质体融合技术选育到一株谷胱甘肽产量明显提高的融合菌株ZJF71,其谷胱甘肽产量分别为亲株的1.59和1.42倍。并对其培养条件进行了研究,结果表明碳源、装液量和培养时间对融合菌株ZJF71生产谷胱甘肽的影响较为显著。在优化的培养条件下,发酵液中谷胱甘肽总量达到185.3mg/L,为初始培养条件下的2.8倍。经遗传稳定性分析,证明融合菌株ZJF-71是遗传稳定的。     

界面上配基种类对BSA吸附行为的影响

利用双偏振极化干涉测量仪(DPI)研究了界面上配基种类对BSA吸附行为的影响。采用3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)、3-(甲氨基)丙基三甲氧基硅烷(MAPTMS)和N,N-二乙基-3-氨基丙基三甲氧基硅烷(DAPTMS)对DPI芯片进行了修饰,利用X射线光电子能谱比较了芯片上不同配基的密度,采用原子力显微镜(AFM)和DPI对界面上BSA吸附行为进行了研究。结果表明APTES修饰界面上BSA呈饼状,高配基密度易导致BSA多位点吸附。相同偶联密度条件下BSA在DAPTMS修饰芯片的吸附量高于MAPTMS修饰芯片,但吸附层厚度一致,表明DAPTMS表面上BSA存在聚集现象;AFM扫描结果与DPI分析结果一致,证明了配基密度和种类不仅影响界面上蛋白质吸附量,而且影响蛋白质吸附密度和表面聚集行为。     

小鼠生长过程中肝、肺、肾胶原蛋白与MMP-1含量变化

利用高效液相色谱法(High performance liquid chromatography,HPLC)和酶联免疫吸附实验(Enzyme-linked immunoassay,ELISA)对小鼠生长过程中肝、肺、肾胶原蛋白与基质金属蛋白酶-1(Matrix metalloproteinase-1,MMP-1)含量变化规律进行研究。以0–18周的小鼠肝、肺、肾为研究对象,通过HPLC法对不同周龄小鼠肝、肺、肾中羟脯胺酸(Hydroxyproline,Hyp)含量及比例进行测定,并换算得到胶原蛋白的含量;利用ELISA检测不同周龄小鼠肝、肺、肾中MMP-1的含量和活性。结果表明,小鼠肝、肺、肾中胶原含量各不相同(肺(COL)>肾(COL)>肝(COL)),且随着周龄的增加胶原蛋白含量变化均呈先增加后降低的趋势。其中肝、肺、肾中胶原蛋白含量分别在第9、6、9周达到最高值,分别为5.52 ng/mg、54.10 ng/mg、19.20 ng/mg;9–18周呈缓慢降低趋势。ELISA检测结果表明,小鼠肝、肺、肾中MMP-1的含量随周龄增加呈先降低后增加的趋势,MMP-1活性的变化趋势与之相反。这表明组织内胶原蛋白含量的增加会抑制MMP-1的分泌。     

乳腺生物反应器表达的重组人抗凝血酶Ⅲ的分离纯化

抗凝血酶Ⅲ(AT Ⅲ)是人体内最重要的抗凝血物质,利用转基因技术生产重组人抗凝血酶Ⅲ(rhAT Ⅲ)受到了越来越多的关注,如何有效地将rhAT Ⅲ从转基因羊奶中分离纯化出来是实现其产业化的关键所在。本研究建立了基于等电点沉淀和肝素亲和层析的纯化工艺,实现了rhAT Ⅲ的高效、快速纯化。先用等电点沉淀法,快速去除了占总蛋白50%左右的酪蛋白;然后用肝素亲和层析纯化rhAT Ⅲ,并系统考察了pH值和温度对rhAT Ⅲ稳定性的影响,以及pH值和操作条件(洗脱梯度、流速和上样量)对rhAT Ⅲ分离效果的影响。在优化的条件下,rhAT Ⅲ纯度达到99%以上,蛋白收率达到90%,活性收率约为50%。所建立的纯化工艺简单、快速,rhAT Ⅲ收率高,为今后工艺放大提供了重要的依据和参考。     

基于生物质谱的胶原蛋白定量检测方法

本研究旨在建立一种基于特征多肽的胶原定量检测方法,通过序列比对的方法筛选胶原蛋白特征多肽,利用胰蛋白酶将牛Ⅰ型胶原蛋白标准品进行酶解,采用液质联用技术(HPLC-MS)对特征多肽进行检测,建立特征多肽丰度与胶原蛋白浓度对应关系并用于实际样品分析。结果表明,牛Ⅰ型胶原蛋白中检测出6种特征多肽,其中多肽GEAGPSGPAGPTGAR由于其丰度高且二级质谱稳定适合作为定量检测的特征多肽,多肽信号强度与蛋白浓度(0.1-3.0 mg/m L)呈良好线性关系。将所建方法用于实际样品分析,牛跟腱胶原蛋白含量为90.2%,胶原海绵中胶原蛋白含量为93.4%,检测结果与基于氨基酸组成分析的结果一致。该研究表明基于HPLC-MS的特征多肽分析方法进行胶原蛋白定量检测具有可行性,该方法在含胶原蛋白医疗器械等生物制品质量控制方面具有应用前景。