用于筛选抑制丙型肝炎病毒内部核糖体进入位点活性药物的整合型细胞药物筛选模型的构建和评价

目的：构建一个能用于筛选抑制丙型肝炎病毒内部核糖体进入位点（HCV—IRES）活性药物的整合型细胞药筛模型。方法：构建携带HCV 5＇-UTR调控报告基因分泌型碱性磷酸酶（SEAP）基因的质粒pHCV5’-SEAP和用作筛选标记的pNeo^R,线性化后共转染于Huh-7细胞中,经G418筛选后得到抗性细胞克隆,进行SEAP定量检测筛选后,得到能用于筛选抑制HCV-IRES活性药物的整合型细胞药筛模型;连续培养24代,用MTT法测细胞相对活力评价该药筛模型的生长稳定性,用SEAP定量检测法评价该药筛模型的SEAP表达稳定性,用反义寡聚核苷酸抑制试验评价模型的药筛灵敏度。结果：G418筛选后得到26个抗性细胞克隆;对其中5个抗性细胞克隆进行SEAP定量检测筛选后,得到3个能表达SEAP的阳性细胞克隆;连续培养24代过程中,该药筛模型的生长稳定性大干80％,SEAP表达稳定性达95％。结论：构建的细胞模型具有良好的稳定性和药筛灵敏度,符合作为药物筛选模型的要求。     

面包酵母海藻糖积累条件的研究

对面包酵母的海藻糖积累条件及补料分批发酵进行了研究。结果表明 pH为 5 .0 ,温度 37℃有利于海藻糖积累。少量多次的补加葡萄糖可持续增加海藻糖的含量 ,但随着发酵时间的延长 ,葡萄糖对海藻糖转化率有逐渐减少的趋势。     

以甘蔗糖蜜为碳源发酵生产海藻糖的研究

对以甘蔗糖蜜为碳源生产海藻糖的工艺条件进行了研究,结果表明,甘蔗糖蜜完全可以提供酵母菌体生长和海藻糖合成所需的碳源,以28g鲜酵母/L的接种量,流加培养14d(其中培养11h后调pH至5.0,加入1.5%NaCl,升温至39℃继续培养3h),可使海藻糖的产量达9.4g/L。     

粘红酵母发酵生产类胡萝卜素培养条件的优化

目的是通过测定不同条件下类胡萝卜素的产量找出粘红酵母发酵生产类胡萝卜素的最优条件。探讨了不同碳源、氮源对粘红酵母菌体生长和色素形成的影响,并通过正交实验确定了最佳条件组合。实验结果表明,最适发酵培养条件为：蔗糖40g/L、酵母粉20g/L、转速150r/min、装液量30mL/500mL、发酵时间84h。在此条件下,粘红酵母摇瓶发酵的生物量、类胡萝卜素含量及产量分别达15.17g/L、718.6μg/g、10.9mg/L,依次比初始发酵提高了1倍、7.4倍和15.8倍。发酵过程动态分析表明,84h色素产量达最高峰。     

利用制糖废蜜流加培养酵母的动力学研究

研究了以廉价原料糖蜜流加培养酵母的生产工艺,确定了最佳工艺参数,并根据酵母在流加培养过程中比生长速率和耗糖速率的变化,对动态的糖流加工艺进行研究,得出了流加培养的动力学模型,然后通过流加培养过程中实际糖流加曲线对所提出的模型进行验证。研究结果表明,流加培养模型能较好地反映酵母流加培养过程中糖流加的规律,对酵母的流加培养具有一定的指导意义。     

三种鹅膏菌培养条件及所产肽类毒素的比较研究

以外生菌根菌鹅膏菌属三个种Amanita muscaria,A.pseudoporphyria和A.fritillaria为研究材料,以生长速率为评价指标,对其最适生长温度、pH值、光照、培养基、C及N源的利用等基本培养条件及所产肽类毒素进行了比较研究。研究结果表明,三种菌株最适生长温度有差异,A.pseudoporphyria和A.fritillaria的最适温度为28℃,A.muscaria的最适温度为22℃;A.muscaria菌丝体生长的pH值范围为5-7,另外两个菌株的pH值范围为3-6;24h光照、12h光暗交替和24h黑暗对鹅膏菌的生长速率影响不大;SPDM培养基和MMN培养基都适合三种菌株的生长,但对于A.muscaria来说PDM培养基更适合其生长。鹅膏菌能够利用比较广泛的C、N源,但三个种在利用的C、N源种类上有一定的差别。通过抑芽法实验和HPLC分析分别表明三种鹅膏菌所含肽类毒素在种类和含量上有所不同,但都对绿豆发芽有一定的抑制作用。A.pseudoporphyria和A.fritillaria菌丝体中α-amanitin的含量分别为35.56μg/gDCW(drycellweight细胞干重)和26.02μg/gDCW,不含有phalloidin和β-amanitin;A.muscaria菌丝体中没有检测到α-amanitin、β-amanitin和phalloidin。结果表明供试的三种鹅膏菌在基本培养条件及所产肽类毒素方面存在种水平上的差异。     

优良面包酵母菌株的杂交育种

本文对实验室保存的面包酵母进行筛选,以不加糖面团发酵力最高的菌株BY-14和高糖面团发酵力最高的菌株BY-6作为两杂交亲本.二倍体菌株经过单倍体制备、分离和筛选后,利用群体杂交方法,获得了一株兼备两亲本优良性能的面包酵母菌株,其不加糖面团发酵力达到菌株BY-14水平,且高糖面团发酵力比菌株BY-6提高了25%.     

酵母海藻糖酶缺失突变株的构建及其耐性

[目的]构建酵母海藻糖酶缺失突变株,并进行耐性分析,进一步研究海藻糖与酵母耐性之间的关系,为商业生产打下一定的基础.[方法]利用同源重组的方法,敲除了编码酸性海藻糖酶的ATH1基因和中性海藻糖酶的NTH1基因,构建了酸性海藻糖酶缺失突变株(△ath1)、中性海藻糖酶缺失突变株(△nth1)和双缺失突变株(△ath1△nth1),并进行了耐性分析.[结果]结合PCR和Southernblot的结果,验证了突变株构建的正确.所有突变株的海藻糖积累量和细胞密度均高于亲本,冷冻、高温、高糖和酒精耐性提高了.[结论]说明海藻糖含量与酵母耐性有一定的相关性.突变株耐性的改善,表明它们在酿造和烘焙产业中具有潜在的商业价值.     

mal62 基因高表达对工业面包酵母发酵力的影响

【目的】构建高麦芽糖利用能力的面包酵母菌株,以期提高面包酵母在不加糖面团中的发酵力,增加经济效益的同时减少成本消耗。【方法】克隆工业面包酵母BY-14的麦芽糖酶基因mal62,以PGK1强启动子和终止子为调控元件,以酵母-大肠穿梭型质粒Yep-C为载体,构建重组表达质粒Yep-CPM,并转化酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY-14,经筛选鉴定获得酵母转化子BYCPM。进行转化子的酶活力、mal62基因表达水平及发酵力测定,检测目的基因的功能性表达。【结果】工业酵母转化子BYCPM的最大麦芽糖酶活力比对照菌提高15%-52%,发酵力提高40%,比发酵力提高5.6%。【结论】转化子BYCPM具有更高的麦芽糖酶活力和更强的抗葡萄糖阻遏能力。并且在不加糖面团中,转化子具有更高的发酵力,可以在更短的时间内获得更大的产气量且消耗更少的碳源。     

代谢工程改造解脂耶氏酵母合成植物萜类化合物的研究进展

萜类化合物是一类广泛存在于植物中的天然产物,其在食品、药品和化工等多个领域中均有广泛的用途,市场潜力巨大。因此,开发生产萜类化合物等植物天然产物可再生的微生物资源来补充甚至代替原有稀少和珍贵的植物资源,具有重要的理论意义和潜在的应用价值。解脂耶氏酵母是目前使用最广泛的非常规酵母底盘细胞之一。近年来,利用代谢工程及合成生物学技术在解脂耶氏酵母底盘细胞中重构与优化萜类化合物的合成途径以实现目标代谢产物的高效合成,已经成为一项研究热点。本文系统总结了有关利用解脂耶氏酵母作为底盘细胞异源生产植物萜类化合物的具体实例和最新进展,包括所涉及的宿主菌株、关键酶、代谢途径及改造策略等,并在最后对该领域的未来发展方向进行了展望。