水翁悬浮细胞系的建立及其悬浮培养的生长特性

建立了水翁悬浮细胞系,并对其悬浮培养的生长特性作了初步探讨。以水翁新生芽尖作为外植体,接种于添加有不同浓度和配比的生长调节物质及各种附加物的MS固体培养基中,诱导培养产生初代愈伤组织;挑选Ⅰ和Ⅱ型的愈伤组织进行继代培养改良,考察愈伤组织的生长状况和统计生长量来决定最佳继代培养基的配方和得到适合悬浮培养的愈伤组织;将以上得到的愈伤组织转接于最佳继代液体培养基中,于24±1℃,120r/min条件下振荡培养,筛选分散度好、较均匀、生长快、色浅透明的细胞作为种子传代,数次传代后得到性能良好的悬浮细胞系;以细胞生长量(鲜重)为指标,绘制了水翁悬浮细胞的生长曲线。研究表明:2.0mg/L的2,4-D的诱导率最高(92%,初代愈伤组织为Ⅰ型),Ⅱ型愈伤组织的最高诱导率为75%;最佳的继代培养基配方为MS 0.5mg/L 2,4-D 0.5mg/L 6-BA 1.0mg/L IAA 0.5mg/L IBA 0.5mg/L NAA 0.1mg/L KT 700mg/L LH,形成Ⅱ型愈伤组织的生长量可达3.28g/瓶(鲜重);液体继代培养3代后,可得到性能良好的悬浮细胞系;水翁悬浮细胞的生长曲线表明,最佳接种期为培养后的16~18d。     

平台化学品短链支链脂肪酸和短链支链醇的微生物代谢工程

短链支链脂肪酸和短链支链醇均为重要的平台化学品,是合成多种高附加值产品的前体物质,市场需求巨大。目前两者的生产主要是利用基于石化原料的化学合成法。化学合成法存在着严重依赖化石燃料、反应效率低以及极易造成环境污染等缺点。微生物代谢工程的快速发展为这些平台化学品的生产提供了一条极具潜力的生物合成路线。利用微生物代谢工程技术构建生产这些平台化学品的微生物细胞工厂具有绿色清洁、可持续发展和经济效益好等独特优势。本文系统综述了近年来微生物代谢工程技术在短链支链脂肪酸和短链支链醇合成方面的研究进展,包括所涉及的宿主菌株、关键酶、代谢途径及其改造等,并探讨了未来的发展前景。     

来源于葡萄球菌的N-乙酰神经氨酸裂合酶的基因克隆及性质

葡萄球菌Staphylococcus hominis来源的N-乙酰神经氨酸裂合酶基因shnal(GenBank Accession No.EFS20452.1)构建至pET-28a质粒并在大肠杆菌中得到表达.通过目的蛋白的纯化和酶学性质研究发现,ShNAL是一个四聚体,裂解方向的最适反应pH为8.0;合成方向的最适反应pH为7.5,最适反应温度为45℃.在45℃下孵育2h对ShNAL的活力基本无影响,高于45℃时,活力迅速下降.该酶在pH 5.0～10.0的环境中比较稳定,4℃下放置24 h酶的残余活力在70％以上.ShNAL对N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)、N-乙酰甘露糖胺(Man)和丙酮酸(Pyr)的Km值分别是(4.0±0.2) mmol/L、(131.7±12.1)mmol/L和(35.14±3.2) mmol/L,kcat/Km值分别为1.9 L/(mmol·s)、0.08 L/(mmol·s)和0.08 L/(mmol·s).     

酶-DNS比色法测定酵母海藻糖的研究

确定了以酶-DNA比色法定量测定酵母海藻糖的方法,并对可能影响测定的因素进行了研究。结果表明：酶-DNA比色法无设备条件要求限制,且快速,准确,特异性强。     

萜类合成酶定向进化的新思路

萜类化合物是天然产物中种类最多且主要存在于植物和微生物体内的一类化合物。随着越来越多具有应用价值的萜类化合物被挖掘,其应用前景引起了人们的关注,但由于含量低、提取成本高等缺点,因此制约了萜类化合物的广泛应用。合成生物学的兴起,为异源合成具有应用价值的萜类化合物提供了新思路,使构建定向、高效的微生物细胞工厂成为现实。萜类合成酶常作为萜类化合物异源合成代谢调控的靶酶,但天然的萜类合成酶存在催化效率低、底物专一性差、立体/区域选择性差、稳定性差等问题,严重影响萜类化合物的产量。萜类合成酶的定向进化可以有效地解决上述问题,为实现微生物细胞工厂异源、高效合成萜类化合物奠定基础。本文综述了近年来酶的定向进化技术的最新进展及应用,并提出了萜类合成酶定向进化的策略。     

酿酒酵母高级醇代谢研究进展

高级醇是酿酒酵母在饮料酒酿造过程中产生的主要代谢副产物之一。饮料酒中高级醇含量过高,易导致饮用后产生头痛、口渴等症状,是醉酒较慢、醉酒后较难醒酒的主要原因。文中系统综述了饮料酒中主要高级醇的风味特征、代谢途径及诱变育种技术在酿酒酵母高级醇代谢调控中的应用,特别阐述了代谢工程技术在氨基转移酶编码基因、α-酮酸代谢基因、乙酸酯代谢基因与碳氮代谢基因改造中的应用,并对未来实现高级醇代谢途径精细化调控的发展方向进行了展望。文中总结对于酿酒酵母高级醇代谢调控系统的建立具有重要的理论意义,对于适量产生高级醇的酿酒酵母工业菌株的选育具有重要的实际指导意义。     

RBS文库调控重组大肠杆菌β-胡萝卜素合成途径关键基因提高β-胡萝卜素合成能力

β-胡萝卜素属于类胡萝卜素家族的一员,在药品、保健品、化妆品和食品行业有广泛的应用。本研究通过用RBS文库对重组大肠杆菌CAR005中β-胡萝卜素合成途径的关键基因dxs、idi和crt操纵子进行调控来提高β-胡萝卜素合成能力。研究发现3个基因分别用RBS文库调控后,与起始菌株相比β-胡萝卜素产量最高分别有7%、11%和17%的提高,表明使用RBS文库调控比使用多个固定强度启动子调控能筛选到更有利于目标产品合成的基因表达强度。三基因组合调控后,β-胡萝卜素产量相对于CAR005菌株提高了35%。同时发现,单基因文库筛选到的最优强度对于组合调控来说,未必是最优强度。本研究为利用基因表达调控优化目标产物合成途径提供了一种新的方案。