我国北方地区鲤浮肿病毒的流行情况调查与监测分析

为进一步确认及掌握鲤浮肿病毒(Carp Edema Virus, CEV)目前的流行现状和流行特点,于2017年重点调查了我国北方地区5省市26个正发生或曾经发生“鲤急性烂鳃病”的养殖场, 随机监测了9个省市的97家鲤和锦鲤养殖场。样品采用实时荧光定量PCR(Quantitative real time PCR,qPCR)法和套式PCR(Nest PCR)方法进行检测, nest PCR法扩增出的产物进行测序和基因分析。结果重点调查的26家养殖场中有20个为CEV阳性, 1个为锦鲤疱疹病毒(Koi Herpes Virus, KHV)阳性, 1个为孢子虫感染。随机调查的97家养殖场中有50家为CEV检测阳性, 阳性率高达52%; 可测序的CEV毒株均属于Genogroup Ⅱa型; 样品按不同地区、不同采样水温、不同品种、不同规格鱼等划分, 各组均有CEV阳性检出, 但检出率均无显著差异。以上结果表明CEV感染是多省市“鲤急性烂鳃病”暴发的主要病因。另外, 该病毒病的流行水温在12—27℃。     

假单胞菌M18中藤黄绿菌素合成限速酶基因的鉴定及表达优化

【目的】假单胞菌株M18中负责抗真菌剂藤黄绿菌素(Plt)合成的结构基因包括pltLABCDEFG、pltM。为了鉴定Plt合成限速酶的基因,分别将9个结构基因过表达。【方法】以M18菌株染色体DNA为模板,PCR扩增这9个Plt合成基因的编码区,分别克隆到穿梭载体pME6032的tac启动子下游,构建9个结构基因的过表达载体,并转入假单胞菌株M18中。在KMB培养基中进行Plt发酵分析。【结果】分别携带pltC、pltD、pltF过表达载体的菌株与携带空质粒的菌株相比,Plt产量分别提高了96%、78%、75%。对重组菌株进行IPTG诱导浓度和诱导时间的优化,确定IPTG最佳诱导浓度为1.0 mmol/L,最佳诱导时间为培养6 h。【结论】pltC、pltD、pltF分别编码的Ⅰ型聚酮合成酶、卤化酶、乙酰CoA合成酶可能为Plt生物合成的限速酶。按照优化条件发酵,携带pltD、pltF过表达质粒的菌株产量分别上升77.5%、159.1%。     

根癌农杆菌介导合欢转TaNHX2基因体系的优化

通过对农杆菌菌液浓度、侵染时间、预培养时间和共培养时间等影响转化效率的因素进行优化,建立了合欢农杆菌转化体系。在此基础上,利用农杆菌介导法将TaNHX2基因导入合欢基因组内,获得大量Kan抗性再生植株。常规PCR和实时荧光PCR检测结果表明,外源基因已整合到合欢基因组中,并正常转录。     

杂交鲟海豚链球菌的分离、鉴定及药物敏感性

【目的】2012年7月,北京市怀柔区一家养殖场的杂交鲟爆发疾病,陆续死鱼。为确定病原,【方法】从具有典型症状的患病鱼的肝、肾和脾中分离获得3株分离菌,编号HRS12718L、HRS12718K和HRS12718S。采用形态特征、理化特性、16S rDNA和海豚链球菌特异性基因逐步鉴定病原菌的种类。取HRS12718K分离株进行人工感染实验,确认病原菌的致病性。开展药物敏感性实验筛选分离株的敏感药物。【结果】结果显示3株分离菌的形态特征和理化特性与从中国其它鱼类分离的海豚链球菌一致。采用16S rDNA序列构建的进化树与海豚链球菌聚为一支,与海豚链球菌的同源性在99.1%以上。HRS12718K分离株对杂交鲟的半致死量LD50为4.42×105CFU/mL,试验感染鱼出现与自然发病鱼相似临床症状。分离株对诺氟沙星、嗯诺沙星、硫酸新霉素、盐酸多西环素和盐酸四环素敏感,尤其对嗯诺沙星敏感。【结论】最终确认引起该养殖场杂交鲟发病的病原为海豚链球菌,建议使用嗯诺沙星进行治疗。     

植物表型可塑性研究进展

表型可塑性已成为生态进化发育生物学的核心概念,很大程度上由于植物可塑性研究的主要贡献,但人们仍远未完全了解表型可塑性的原因和结果。从整体角度理出表型可塑性研究发展的基本脉络,介绍研究内容、途径和简史,聚焦于几个主要方面的研究进展及发展方向。现代可塑性研究的兴盛始于关于可塑性的进化学重要性的一篇综述,从现象的描述、对其遗传基础和可塑性本身进化的讨论,发展到探索其背后的发育机制、植物生长与适应策略、生态学影响等。未来可塑性研究应在重新理解和评价表型可塑性及其适应性的基础上,更关注自然条件下环境因子和可塑响应的复杂性。表型可塑性的生态-进化学意义仍将是未来研究的重点。     

AmoA、AmoE和AmoF蛋白在嗜水气单胞菌铁载体合成中的作用研究

铁载体被认为是嗜水气单胞菌的毒力因子之一, 其由amoCEBFAGH七个基因编码, AmoCGH在前人的研究中已证实参与铁载体的合成。RT-PCR实验表明amoAEF基因的表达受到铁的调控。为进一步探究amoAEF基因的功能, 利用融合PCR和基因同源重组原理, 以自杀性质粒PRE112为载体构建基因缺失株ΔamoA、ΔamoE和ΔamoF。通过CAS平板检测实验以及arnow实验来检测野生株WT与各基因缺失突变株铁载体的合成情况, 并比较野生株与各缺失株在低铁培养基中的生长差异。结果显示, 成功构建了基因缺失株ΔamoA、ΔamoE和ΔamoF; 在富铁条件下, 基因缺失株ΔamoA、ΔamoE和ΔamoF的生长与野生株无显著性差异, 但在低铁条件下, 基因缺失株ΔamoA、ΔamoE和ΔamoF的生长能力、铁载体合成能力显著低于野生株。可见, amoA、amoE和amoF基因是嗜水气单胞菌铁载体合成的关键基因, 其缺失会导致细菌在低铁环境中的生长受到抑制。     

卵形鲳鲹组织蛋白酶B基因的克隆及表达分析

为研究卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)组织蛋白酶B(Cathepsin B, CatB)基因的表达特征和功能, 应用RT-PCR和RACE技术获得卵形鲳鲹CatB(TroCatB)基因的全长cDNA。TroCatB cDNA全长为2181 bp。其中5′UTR和3′UTR分别为391和797 bp, ORF为993 bp, 推定编码330个氨基酸残基, 推定分子质量和理论等电点分别为36.37 kD和5.73。蛋白结构预测TroCatB蛋白具有信号肽(1Met-18Ala)、前体肽(25Leu-64Gly)和一个典型木瓜蛋白酶家族半胱氨酸结构域, 含107Cys、277His、297Asn 3个蛋白酶催化活性位点。同源性分析显示TroCatB蛋白与其他脊椎动物的同源性为67.0%—90.9%, 成熟肽区与其他脊椎动物的同源性为73.7%—92.4%。NJ系统发育树显示卵形鲳鲹和其他鱼类聚为一支, 与髙体鰤距离最近。实时荧光定量PCR检测TroCatB基因mRNA在健康卵形鲳鲹各组织中均有表达, 在脾脏中表达最高; 在溶藻弧菌感染后, TroCatB基因在脾脏、头肾组织中的mRNA表达水平显著上调(P<0.05), 脾脏在感染6h后, 其表达量达到峰值, 头肾则是在12h达到峰值。以上结果表明, TroCatB蛋白的结构域和催化活性位点在遗传进化过程中保守, TroCatB基因参与了机体对细菌免疫的相关生理活动, 在卵形鲳鲹先天性免疫防御中发挥重要作用, 为进一步阐明TroCatB在免疫过程中的功能以及其对病原的抗病机理提供参考。     

IHNV单克隆抗体的制备及其初步应用

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牛呼吸道合胞体病毒核蛋白的表达及其单克隆抗体的制备

利用牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)接种牛肺细胞(BL),提取病毒RNA。通过RT-PCR扩增BRSV的核蛋白基因,然后定向克隆到原核表达载体pET30a,获得重组表达质粒pET30a-N。将重组质粒转化表达菌BL21(DE3),经增菌培养和IPTG诱导以及SDS-PAGE和Western blot分析,成功表达出了核蛋白(N),其分子量约为49kDa。为制备BRSV核蛋白的单克隆抗体,用纯化的重组核蛋白免疫BALB/c小鼠,取免疫鼠脾细胞与SP2/0细胞融合。采用以BRSV为检测抗原的间接ELISA筛选阳性细胞克隆,经3次克隆纯化后获得2株稳定分泌抗N特异性MAb的杂交瘤细胞株,分别命名为2D12与4B10。用2D12与4B10杂交瘤细胞株接种BALB/c小鼠制备腹水,采用rN及BRSV包被的ELISA测得的效价分别是1×105和1×106及1×102和1×103。间接ELISA、Western blot、IFA试验表明两株杂交瘤细胞所分泌的MAb具有良好的反应性和特异性。经抗体亚类鉴定D12与4B10均为IgG1/κ。特异性试验表明单抗2D12与4B10均不与牛副流感病毒3型和牛病毒性腹泻病毒反应。所制备的D12与4B10可用于建立检测BRSV病原及抗体的诊断方法。