纳豆激酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

纳豆激酶纳是从日本传统食品纳豆中发现的一类具有溶栓效果的蛋白酶,由于其具有安全,高效,作用时间长,易吸收,廉价等优点,现在正成为一个开发治疗血栓类疾病药物的研究热点。从本实验室保存的一株高溶栓的纳豆杆菌N07出发,提取总基因组DNA,利用PCR手段扩增获得了纳豆激酶长为825bp的成熟肽基因片段。构建重组表达质粒pPICZaA-NK,经EcoR I、Xba I双酶切、PCR、测序验证得出重组表达质粒上的外源基因即为825bp的目的片段;将重组质粒pPICZaA-NK用内切酶Sac I线性化后电击导入毕赤酵母X33,通过含Zeocin的YPDS平板筛选获得重组酵母。重组酵母在BMMY培养基中发酵培养,用1%甲醇诱导目的蛋白表达。用纤维蛋白平板法检测发现发酵上清具有纤溶活性,经硫酸铵盐析、透析、Sephadex-G50过柱等步骤分离得到纳豆激酶蛋白,进行SDS-PAGE鉴定表明,表达的纳豆激酶蛋白分子量为27KD。以尿激酶为标准,实验所得纳豆激酶发酵上清液溶栓活性约为195U/mL。成功的将纳豆激酶成熟肽基因在毕赤酵母X33中表达,为纳豆激酶基因工程进一步研究奠定基础。     

白芷细胞外钙调素结合蛋白（ECBP21）免疫组化及金标定位分析

ECBP21是我们从白芷悬浮培养细胞外纯化及cDNA克隆的一种钙调素结合蛋白(CaMBP),亦是植物中首次报道的细胞外CaMBP。本实验以大肠杆菌表达的重组ECBP21蛋白为抗原,制备了高效价特异性抗体;随后,利用免疫组化及金标定位技术,研究了ECBP21蛋白组织特异性分布及亚细胞定位。免疫组化结果表明：ECBP21在白芷各组织中均有分布,但在叶、花、花序轴中较多,而在根中较少,并且ECBP21在细胞中多分布于细胞壁区域;免疫胶体金电镜定位结果显示：在白芷花序轴细胞中金颗粒主要分布在细胞壁,表明ECBP21蛋白主要定位于细胞壁区域,从而首次为细胞外CaMBP(ECBP21)的胞外存在提供了直观证据,并为进一步研究其在植物生长发育中的功能提供了初步信息。     

细菌性肝脓肿临床特点的回顾性分析

目的:总结细菌性肝脓肿(pyogenic liver abscesses,PLA)的临床特点、诊断及治疗经验,提高诊疗水平。方法:回顾性分析哈尔滨医科大学第二临床医学院2013年1月-2014年12月收治的75例PLA患者的临床资料。结果:75例患者的平均年龄57岁,最大78岁,最小34岁。其中,男45例,女30例,男:女为1.5:1。75例患者中表现为发热者69例(92.0%)、寒战28例(37.3%)、右上腹痛66例(88.0%),伴恶心呕吐者28例(37.3%),黄疸15例(20.0%),肝肿大8例(10.7%)。有糖尿病病史患者28例(37.3%)。胆系疾病(78.7%)是本组资料主要的易患因素,其中53例患有胆囊炎(70.7%)。外周血白细胞增高67例(89.3%),血红蛋白降低41例(54.7%),白蛋白降低46例(61.3%);75例患者转氨酶升高58例(77.3%)。肝右叶单发脓肿多见(75例患者中36例,占48%)。51例B超确诊,24例行B超+CT或CT检查。48例行穿刺液细菌培养及25例血培养,其中肺炎克雷伯氏菌为主要病原菌。平均住院天数为19天,多数患者经皮下肝脓肿穿刺或置管引流而好转,1例漏诊为肺炎,2例患者反复入院,1例因菌血症死亡。结论:PLA的临床表现多样,以发热最为常见;多为肝右叶单发,部分患者血红蛋白及血清白蛋白降低。糖尿病为PLA最常见基础疾病,胆系疾病是主要的易患因素。肺炎克雷伯杆菌是本组PLA患者的主要致病菌。     

螺旋CT扫描及三维重建技术在股骨颈骨折分型及治疗中的应用

目的:探讨螺旋CT扫描及三维重建技术在股骨颈骨折分型及治疗中的应用价值。方法:选择2010年5月~2013年5月期间我院收治的股骨颈骨折患者237例为研究对象,根据患者扫描检查方式的不同将其分为对照组(112例)和观察组(125例),对照组患者行髋关节X线正位扫描,观察组行髋关节正位64排螺旋CT扫描,两组均根据扫描结果进行分型并制定相应的治疗方案,比较两组患者骨折内固定手术后2年的股骨头坏死率及骨折不愈合率。结果:两组行骨折内固定手术比例比较,差异无统计学意义(P0.05);术后2年,对照组股骨头坏死5例(22.73%),骨不连6例(27.27%);观察组股骨头坏死1例(3.70%),骨不连1例(3.70%),观察组患者股骨头坏死率及骨折不愈合率均显著低于对照组,差异均有统计学意义(P0.05)。结论:螺旋CT扫描及三维重建成像能够全面、准确显示股骨颈骨折的损伤情况,有助于骨折的正确分型和治疗方法的选择,改善预后。     

开垦对阿拉善荒漠啮齿动物群落功能多样性的影响

开垦会导致荒漠化的加剧,并对动物群落产生严重的影响。而功能多样性恰恰能体现环境或干扰胁迫导致的群落结构差异。但有关啮齿动物群落功能多样性的研究并不多见,为此,我们在2018至2020年的4月、7月和10月利用铗日法对开垦区和未开垦区的啮齿动物群落进行调查,选择并量化了与其营养、生活史、生理、形态及活动节律等相关的5个功能性状,以探讨开垦对啮齿动物群落组成的影响,以及性状组成和功能多样性变化。研究结果表明：(1)开垦区群落的丰富度指数、多样性指数和均匀度指数均低于未开垦区,开垦改变了啮齿动物群落性状组成;(2)阿拉善荒漠啮齿动物群落组成与蛰眠、繁殖周期和食性等功能性状显著相关;(3)开垦区春、秋季群落功能丰富度和功能均匀度高于未开垦区,各季节群落功能离散度显著高于未开垦区;而未开垦区夏季群落功能丰富度高于开垦区,秋季群落功能均匀度高于开垦区;(4)开垦区和未开垦区群落功能丰富度最高值均出现在夏季,二者在不同季节间差异较大;开垦区群落功能均匀度最高值出现在春季、功能离散度最高值出现在秋季,二者在季节间差异均较小;未开垦群落功能均匀度最高值出现在秋季、功能离散度最高值出现在夏季,二者在季节间差异均较大。上述结果说明,阿拉善荒漠区啮齿动物群落功能多样性变化与土地开垦和季节相关联,开垦会从啮齿动物群落的生态空间利用程度、资源利用、种间竞争及生态位等方面影响群落功能多样性。     

犬冠状病毒S蛋白主要抗原区基因片断的表达及免疫原性

应用Pichia pastoris酵母表达了犬冠状病毒大熊猫野毒株(CCV DXMV)S蛋白主要抗原区基因片断。用特异性引物扩增出CCV DXMV株S1基因片断,并将其克隆到pGEM-T载体中得到pTS1。用KpnI和Notl双酶切pTS1回收目的基因S1定向克隆到pPICZCαA中,构建出重组质粒pPICZCαAS1。将pPICZCαASl用SacI内切酶线性化后,电转化感受态GS115酵母细胞,用PCR法筛选阳性重组子。用1％的甲醇诱导重组酵母菌,取培养物上清进行重组蛋白的检测。结果重组酵母菌培养物上清用SDS-PAGE电泳可检测到相对分子量为106kDa大小的重组蛋白,Westem-blot证实该重组蛋白可以与CCV多克隆抗体发生特异性血清学反应。凝胶薄层扫描分析表明,3株重组酵母菌在1％甲醇诱导144h后,重组蛋白S1表达量约占培养物上清总蛋白量的6．6-8．6％左右。用重组蛋白S1免疫BALB／C小鼠3次后,小鼠血清CCV中和抗体可达1：8-1：16,表明重组S1蛋白具有一定的免疫原性。     

产漆酶的草菇菌株的筛选

以Bavendamn反应和愈创木酚滴定法为初筛方法,从18株草菇中筛选高产漆酶菌株.结果表明,在加入了0.4mmol/L鞣酸的Bavendamn培养基平板上,通过所显颜色深度及显色圈直径选出13株强阳性菌株;以愈创木酚滴定法筛选出5株显色时间较短且显色较深的菌株.最后,通过液体发酵复筛,测得V123菌株酶活最高,培养8d其漆酶达78U/mL,其次是V8菌株活力为65U/mL.V123和V8可作为草菇中漆酶的高产菌株供以后的研究.     

胃镜对咽喉部恶性病变诊断的临床应用价值

目的:探讨胃镜在对于咽喉部恶性疾病诊断的临床应用价值。方法:对2013年11月至2014年9月因声音嘶哑或咽部异物感或吞咽困难为主诉就诊的患者,给予电子喉镜或间接喉镜检查,以在喉镜下发现咽喉部肿物或喉镜下发现黏膜异常增生不能明确判定病灶性质的12例患者为研究对象。继而给予窄带成像(Narrow-band imaging,NBI)及放大胃镜检查,对病灶进行性质及病变范围的判定。病理结果作为金标准,比较喉镜及胃镜两种方式对咽喉恶性病灶的正确诊断率。结果:12例患者中共发现15处病灶,其中炎性反应5处,单纯性鳞状上皮增生3处,鳞状细胞癌6处,神经纤维瘤1处。喉镜对病灶的正确诊断率是40.0%(6/15),NBI放大胃镜对病灶的正确诊断率是93.3%(14/15),两者差异有统计学意义(x~2=9.60,P=0.005)。结论:NBI放大胃镜对咽喉部肿瘤诊断正确率高于普通喉镜,充分证明了胃镜在咽喉部恶性疾病的诊断方面的临床价值。在行胃镜检查时,同时对咽喉部进行仔细观察检查是十分必要的。     

犬冠状病毒流行株膜蛋白基因序列分析及其表达研究

对国内分离的犬冠状病毒(CCoV)DXMV、V1和V2流行毒株膜蛋白(M)基因进行了扩增、测序和遗传进化分析。3个CCoV流行毒株M基因全长均为792bp,编码263个氨基酸,其中前17个氨基酸为信号肽。DXMV、V1和V2流行株与Insavc-1疫苗株M基因相比,核苷酸的同源性分别为92.6%、90.9%和91.6%,推导的氨基酸序列的同源性分别为92.5%、92.0%和92.3%,在M基因前1/3区域内存在变异,其中74-76、120-124和131-135三个区域变异较大。国内DXMV、V1、V2、NJ1和NJ1-175个流行株M基因核苷酸同源性为96.6%,推导的氨基酸序列同源性为96.4%,显示出很高的保守性。基于M基因的遗传进化分析表明,目前国内绝大多数CCoV流行毒株都属于CCoV基因II型,只有Fox3-1和Rac2-1两个毒株属于基因I型。另外,将DXMV株M基因亚克隆到pET28a中,在BL21(DE3)中实现了M蛋白的表达,表达量约占菌体蛋白的10.2%。     

植物的钙调素亚型

钙调素是一种高度保守的多功能Ca2 结合蛋白,在Ca2 信号转导途径中处于中心环节.近年来的研究表明,CaM亚型在植物中普遍存在,不同的CaM亚型与靶蛋白相互作用,它们的表达特性和生物学功能存在差异.该文介绍了植物 CaM亚型的研究现状和进展.