杆状病毒介导的哺乳动物细胞基因转移及其影响因素

杆状病毒作为优良的哺乳动物细胞基因转移载体已在基因治疗、疫苗开发、药物筛选以及基因调控研究等方面发挥巨大作用。但杆状病毒对哺乳动物细胞的嗜性不够广泛、转导效率和转基因表达水平偏低,以及表达持续时间短暂等问题制约其进一步发展,因此如何突破这个制约的瓶颈成为学者们新的关注焦点。针对以上问题,围绕杆状病毒介导哺乳动物细胞基因转移的各种影响因素进行综述。     

BrdU抗血清制备和应用的研究——Ⅰ.高度特异的BrdU抗血清的制备与特性

半抗原BrU通过与BSA偶联制备了完全抗原,经过光吸收、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖凝胶电泳的测定表明,核苷-蛋白质复合物符合制备的要求,每个BSA上估计大约平均有10.3个BrU。用常规免疫的方法获得兔抗BrdU的抗血清,与BrU-EA的双向扩散效价高达32。抗血清稀释128万倍时仍可见明显的ELISA阳性反应。与以前所报道的BrdU抗血清不同,该抗血清具有高水平的识别能力,已达到BrdU单克隆抗体的识别水平,无须纯化即可用于染色体及核酸的研究。     

糖甜菜三体系列的建立与鉴定初报

以双丰303品种(3x=27)为母本与双丰五号(2x=18)为父本进行杂交,于其子代(F_1)中获得糖甜菜三体606株。三体产生机率为33.5％。根据植株形态特征及有丝分裂晚前期或前中期染色体形态特点,鉴定出9种三体类型。按形态特征及附加染色体序号对各种三体类型命名如下:Ⅰ、辣根型(即附加的是第一号染色体,以下类推);Ⅱ、长叶柄型;Ⅲ、萝卜型;Ⅳ、莴苣型;Ⅴ、玻璃型;Ⅵ、细长叶型;Ⅶ、花叶型;Ⅷ、匍伏型;Ⅸ、拟正常型。这是首次建成糖甜菜完整的初级三体系列,并按染色体鉴定与命名的初步报道。同时讨论了存在的问题及进一步研究的方向。     

BrdU抗血清制备和应用的研究——Ⅱ.应用BrdU抗体技术显示BrdU标记的染色体和DNA

使用高度特异的BrdU抗血清,通过酶标第二抗体和DAB-H_2O_2或AEC-H_2O_2显色法,成功地显示了CHO和人染色体的BrdU标记区域。使用同样的程序和方法亦成功地显示了硝酸纤维膜上pg水平的BrdU-DNA印迹点。     

构建基于杆状病毒的BV-T7杂合表达体系及利用其在哺乳动物和禽类细胞中表达eGFP基因

【目的】研究重组杆状病毒BV-T7杂合表达体系能否有效转导禽类细胞并在禽类细胞中表达外源基因(eGFP),从而构建能在禽类细胞中高效稳定表达外源基因的重组杆状病毒表达系统。【方法】本研究利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,结合T7表达系统,通过对eGFP表达水平的调控来把握噬菌体T7 RNA聚合酶(T7 RNAP)的功能。利用两支重组杆状病毒,pFastBac-CMV-T7 RNAP重组杆状病毒为哺乳动物细胞启动子CMV调控的噬菌体T7 RNA聚合酶的cDNA;pFB-T7pro-IRES-GFP-T7ter重组杆状病毒为T7启动子控制的eGFP报告基因。将两支重组杆状病毒共同侵染哺乳动物OL(oligodendrocyte)细胞、鸡胚成纤维细胞和鸡胚骨骼肌细胞。【结果】两支重组杆状病毒利用T7启动子和T7 RNAP,在OL细胞、鸡胚成纤维细胞和鸡胚骨骼肌细胞中成功表达eGFP报告基因,而且未引起细胞病变,但在鸡胚原代细胞中eGFP的表达相对弱于在OL细胞中的表达。在OL细胞中重组杆状病毒对细胞的转导效率为59.5%,在鸡胚成纤维细胞和鸡胚骨骼肌细胞中转导效率分别为23.2%和33.1%。【结论】本研究构建的基于杆状病毒、T7RNA聚合酶、T7启动子(BV-T7)杂合表达体系能够在哺乳类细胞及禽类细胞中表达T7 RNAP,并利用T7RNAP继续高效而稳定地表达外源基因。这为难于体外操作的RNA病毒提供了有效的研究方法,并对新型基因工程疫苗的研制提供了一个高效而稳定的表达载体系统。     

高等植物减数分裂的突变基因

精密有序的减数分裂是一个高度协调的生理、生化和遗传过程,受到许多基因的严格调节和控制。从而保证了物种的稳定性和连续性,保持了物种在生存斗争中不断进化的能力。一般称调节、控制减数分裂过程的基因为减数分裂基因。目前,对减数分裂基因的研究,已成为细胞遗传学的一个重要领域, 减数分裂基因结构或功能的任何改变,都可能引起减数分裂的变化。Gowen[19]等(1922)最先分离和描述了果蝇的不联会突变基因C(3)G。六十多年来,减数分裂突变基因的报道越来越多了。在大约130个高等植物种中,有关联会突变基因的报道就有100种类型。(Gottschalk[13]等,1980a、b;Koduru等1981;Kaul等1985)。研究表明,从前减数分裂的有丝分裂直到减数分裂后子细胞重新开始有丝分裂,整个过程的各种行为部可能受到突变基因的影响。     

以杆状病毒为载体在鸡原代骨骼肌细胞中表达IBDV VP2基因

摘要：【目的】本研究旨在构建在鸡原代骨骼肌细胞中表达IBDV病毒VP2基因的重组杆状病毒。【方法】从IBDV适应细胞毒中提取RNA,用RT-PCR技术扩增VP2基因,将其克隆到自主构建的杆状病毒转移载体的CMV启动子之下,通过Bac-to-Bac系统获得VP2重组Bacmid,并将其转染Sf9昆虫 细胞,获得了VP2重组杆状病毒。重组病毒经扩增后以50个MOI感染鸡原代骨骼肌细胞,接种72h后裂解细胞收获蛋白。【结果】蛋白样品经SDS-PAGE和Western blot证实VP2蛋白获得表达,分子量约48kDa,与预测蛋白大小一致,且能被IBDV阳性血清所识别。【结论】重组杆状病毒可以有效地将VP2基因导入鸡原代细胞,并在CMV的启动下表达具有抗原性的VP2蛋白,本研究为研制IBDV及其他重要禽类传染病的杆状病毒载体疫苗奠定了基础。     

CellProfiler分析重组杆状病毒转导OL细胞的最佳条件

[目的]定量分析重组杆状病毒在少突神经胶质细胞(oligodendrocyte,OL)中的表达水平,为探索重组杆状病毒最佳转导条件。[方法]首先构建重组杆状病毒,将重组杆状病毒转导至OL细胞,通过荧光显微镜观察细胞形态及EGFP表达情况,并采集细胞的数字图像。利用CellProfiler软件对重组杆状病毒在OL细胞中转导后的表达水平进行数字图像分析,得到各个优化条件的EGFP阳性细胞比率及表达强度,绘制图表并分析。[结果]40MOI重组杆状病毒转导OL细胞并添加10 mmol/L丁酸钠,转导时间为12 h,培养时间为72 h时病毒转导效率最高;培养时间为48 h,其它条件相同情况下EGFP表达强度最高。[结论]定量分析优化后,重组杆状病毒转导OL细胞的表达效率及EGFP的表达水平得到显著上调。