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双拷贝基因及其侧翼序列的克隆是分子生物学中的一个难点。将优化的反向PCR(Inverse PCR,iPCR)与TAIL-PCR相结合,有效地克隆双拷贝基因及其侧翼序列。先用Southern blotting方法确定一种能获得合适长度片段的限制性内切酶,然后用优化的iPCR方法对该酶切产物进行自连和扩增,将2个拷贝的侧翼序列区分开。根据iPCR结果,进一步用TAIL-PCR扩增更远侧翼的序列。利用这套方法,获得了棉花可育胞质和不育胞质线粒体双拷贝atpA基因的所有EcoR I限制片段(2.2~5.1 kb)和HindⅢ限制片段(8.5~11.7 kb),克隆到2个拷贝各自的侧翼序列。研究结果说明,优化的iPCR与TAIL-PCR相结合是克隆双拷贝基因及其侧翼序列的一种高效方法。 相似文献
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棉花茎尖转化法具备不受基因型限制、转化周期短的优点,是理想的棉花转化体系,但据报道其所获得的转基因植株普遍存在遗传不稳定、高代植株基因丢失的现象。以陆地棉TM?1品种为受体材料,利用茎尖转化法将DsRed2载体转入棉花,经卡那霉素筛选获得16株抗性植株,进一步PCR扩增靶基因,获得6株DsRed2基因片段PCR检测为阳性的植株,初步判断该6株为茎尖转化法获得的转基因植株,但经紫外照射,6个转基因植株均未检测到红色荧光。对其进行靶基因RT?PCR,发现DsRed2基因在6个转基因植株中仅有极低量的表达或无表达。进一步对DsRed2载体的非T?DNA片段,即载体骨架部分进行PCR以及植株内生菌培养检测,结果表明,6个转基因植株均含有完整的DsRed2载体,植株可培养出含有完整载体的内生菌,且内生菌经农杆菌16S核糖体RNA(16S rRNA)片段PCR检测结果为阳性,推测由于茎尖侵染形成农杆菌与植株共生关系,造成假阳性株的现象,进而导致高代转基因植株基因丢失、遗传不稳定的现象。旨在建立一套完整的茎尖法转基因棉花植株真实性的鉴定方法,为进一步深入研究提供参考依据。 相似文献
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