实时定量RT-PCR检测鱼类传染性造血器官坏死病毒方法的建立与应用

建立了Taqman 实时定量RT-PCR方法检测传染性造血器官坏死病毒(IHNV).选取IHNV病毒的N蛋白基因保守序列,利用Primer Express 2.0软件设计引物和探针.以梯度稀释的含有IHNV目的扩增片段的质粒作为标准品,进行定量RT-PCR反应以确定检测灵敏度.病毒浓度在5×106 -5个拷贝,共7个数量级的范围内,定量RT-PCR反应有"S"型扩增曲线,检测灵敏度为5个拷贝.根据病毒拷贝数与定量反应Ct值的关系,绘制了标准曲线.该方法具有特异性,对鲤春血症病毒(SVCV)、病毒性出血性败血症(VHSV)、传染性胰脏坏死病毒(IPNV)、草鱼呼肠孤病毒(GCRV)、流行性造血器官坏死病毒(EHNV)、EPC细胞系、牙鲆的核酸都没有扩增反应.在50批待检样品中,有3批鱼类感染IHNV,利用标准曲线进行了定量分析.实时定量RT-PCR检测IHNV方法,灵敏度高,特异性好,可以进行定量分析,在鱼病的快速检测上具有重要意义.     

植物转基因成分PCR检测内对照系统的建立

为了建立适用于多种植物的转基因成分PCR检测的内对照系统,本文针对植物叶绿体DNArbcL基因的保守区域,设计了一对扩增片段为433bp的PCR引物。通过对23种植物的PCR扩增表明,该引物不但在4种单子叶植物（大米,玉米,小麦,洋葱）,10种原始花被亚纲的双子叶植物（甘蓝,白菜,大豆,豇豆,花生,胡萝卜,芹菜,菠菜,大麻,棉花）及7种合瓣花亚纲的双子叶植物（圣女果,番茄,辣椒,马铃薯,南瓜,黄瓜,菊苣）中得到了稳定一致的扩增结果,而且在低等的藻类植物（海,经须菜）中也得到了特异性的扩增结果。进一步对扩增片段进行的DNA序列测定与分析表明,扩增片段的变异水平较低,具有较高的保守性。本系统的建立有助于排除PCR检测时的假阴性结果,从而提高检测的准确性,而且能克服现行的“一种植物一种检测内对照”的弊端,有利于提高检测效率,缩短检测周期。     

空肠弯曲菌LAMP快速检测方法的建立

本研究使用恒温环介导技术, 以空肠弯曲菌的促旋酶基因A(gyrA)设计引物, 建立空肠弯曲菌的LAMP快速检测方法。不同来源的4株空肠弯曲菌LAMP检测均显示阳性, 其他14种细菌LAMP检测显示阴性。实验结果表明, 设计的引物具有良好的特异性。本研究进行了LAMP检测方法与细菌平板计数法和PCR法的灵敏度比较, 结果LAMP检测与PCR法有相近的灵敏度, 比细菌平板计数法灵敏度高3个数量级。我们还研究发现提取核酸前加入DNase可以有效地减少死菌DNA对LAMP结果的影响。使用LAMP方法对鸡法氏囊的检测表明, 结合核酸提取步骤中的DNase处理步骤, 可以准确的检测出鸡法氏囊中的空肠弯曲菌。     

马动脉炎病毒GL蛋白主要抗原域的表达及间接ELISA的初步建立

在分析马动脉炎病毒GL蛋白抗原性的基础上,设计一对引物克隆GL蛋白一段抗原性较好的抗原域编码基因。将克隆的基因插入pET-32a的BamHⅠ和XhoⅠ之间构建了GL蛋白主要抗原域原核表达载体pET-GL1。将pET-GL1质粒转化BL(21)宿主菌后,对培养和表达条件进行了优化,实现了EAV GL蛋白主要抗原域的高效表达。免疫印迹试验表明获得的表达产物具有良好的反应原性。应用His.Bind亲和层析柱纯化重组EAV-GL1蛋白,以纯化的重组GL1蛋白作为检测抗原,初步建立了检测马动脉炎病毒抗体的iGL1-ELISA。结果表明,抗原的最佳包被浓度为9.65μg/mL,血清的最佳稀释度为1∶80,阳性标准初步定为:待检血清OD490>0.4,且待检血清OD490/阴性血清OD490>2。应用iGL1-ELISA对马血清样品进行检测,结果表明iGL1-ELISA与病毒中和试验的符合率达到94.1%,与国外同类试剂盒的符合率达到95.6%。     

果蔬产品中甲型肝炎病毒风险评估和基因分型研究

本研究探讨了果蔬产品中甲肝病毒风险评估和基因分型;采用实时荧光RT-PCR对216个果蔬样品进行了检测,检测出6个阳性样品,分别为冷冻草莓、冷冻蓝莓、冷冻土豆丁、冷冻苹果丁和冷冻树莓样品,占总样品数的2.8%;采用巢式RT-PCR对6个阳性样品进行基因扩增,样品冷冻苹果丁(210-1999)和冷冻蓝莓(210-2002)获得单一条带,经系统进化和同源性分析,二者皆属于甲肝病毒ⅠB亚型;本研究为果蔬产品企业和食品安全管理部门提供了此类产品甲肝病毒污染的风险信息,奠定病毒基因溯源基础,为企业从种植、收获、加工、包装等各关键控制点保证产品安全提供技术支撑,为流行病学诊断提供可靠数据。     

松江鲈鱼Cytb基因序列分析及种质鉴定

采用PCR方法扩增四尾松江鲈鱼线粒体细胞色素b(mitochondrial cytochrome b,Cytb)基因序列,全序列长度为1 141 bp,并建立了松江鲈鱼的实时定量PCR检测方法对该物种进行种质鉴定。分析Cytb基因序列基本特征显示,Cytb基因在第3位密码子表现出明显的反G偏倚,显示出脊椎动物Cytb基因的共同特性。第2位密码子嘧啶的含量远高于嘌呤的含量,有5个位点发生转换,0个位点发生颠换。选取杜父鱼科(Cottidae)的10种鱼类,与松江鲈鱼进行序列分析,构建发育系统树并分析遗传距离,与鲈鱼的亲缘关系最远。以松江鲈鱼Cytb基因序列为靶基因,利用PRIMER EXPRESS2.0软件设计引物和Taqman探针,建立检测松江鲈鱼的定量PCR方法,特异性强,灵敏度高,检测限为3.20×102拷贝/反应。     

温度和营养盐限制对网状原角藻生长与产毒的影响

网状原角藻(Protoceratium reticulatum)是能够形成有毒赤潮的海洋甲藻之一,所产毒素为虾夷扇贝毒素(yessotoxins,YTXs),该藻在全球很多海域中普遍存在,其生长与产毒特征表现出较强的海域差异性。以分离自我国北黄海海域的网状原角藻为实验对象,研究了温度和营养盐(N、P)限制对该藻生长与产毒的影响。研究发现:温度和营养盐限制对藻细胞的生长和产毒均有影响,但营养盐限制影响更为显著。较低的温度更适宜P.reticulatum的生长,15℃时无营养盐限制的L1-Si培养基中藻细胞生长最好。营养盐限制尤其是P限制能够显著降低藻细胞的比生长速率和细胞密度(P0.01),缩短藻细胞指数生长期和稳定期的持续时间。所有温度下N、P限制均有利于藻细胞内毒素累积,15℃P限制培养基中单个藻细胞中YTX毒素最高,达到92.6 pg/细胞,分别是相同培养温度下N限制和L1-Si中藻细胞毒素含量的3.8倍和7.1倍。温度变化对N和P限制下藻细胞毒素含量影响不同:在5—15℃范围内,随温度升高,N限制培养基中藻细胞YTX含量增幅逐渐下降,而P限制条件下反之。在所有培养条件下,滤液中毒素含量在稳定期后开始增多,与L1-Si相比,N、P限制不利于毒素的释放。高温能促进L1-Si培养基和N限制培养基中毒素的释放,但对P限制影响不显著。