巴氏醋杆菌高酸度醋发酵过程的能量代谢分析

【目的】初步分析了Acetobacter pasteurianus CICIM B7003-02在醋酸发酵过程中的能量代谢状况, 通过强化细胞能量代谢水平以提升菌株高酸发酵的产酸强度。【方法】探明A. pasteurianus CICIM B7003-02在高酸度醋发酵的不同阶段中三羧酸循环底物含量、乙醇呼吸链酶活及能量代谢酶基因的转录水平等代谢特点, 分析用于醋酸发酵的产能代谢途径及其作用。【结果】发现A. pasteurianus CICIM B7003-02在醋酸发酵初期, 主要通过苹果酸/琥珀酸回补偶联有氧呼吸途径产能。进入醋酸快速积累阶段, 乙醇呼吸链为主要供能代谢途径。发酵后期苹果酸/琥珀酸回补途径配合乙醇呼吸链供能。基于上述研究, 采取添加琥珀酸和苹果酸强化细胞产能, 促进高酸度醋发酵强度。【结论】能量供给影响醋杆菌耐酸能力和醋酸生产能力。确定乙醇呼吸链为醋酸发酵的主要供能系统。强化细胞产能手段可达到提高醋酸发酵强度的目的。     

Burkholderia cepacia胆固醇酯酶及其分子伴侣基因的串联表达及酶学性质的研究

为实现胆固醇酯酶的可溶性表达,以Burkholderia cepacia ST-200胆固醇酯酶为研究对象,将酶及其分子伴侣通过人工添加的SD序列在大肠杆菌中进行串联表达。通过SDS-PAGE电泳分析,胆固醇酯酶成功获得可溶性表达,摇瓶水平的总酶量为1 077 U/L。经过镍柱纯化之后可以获得一条相对分子量约为37 kDa的单一条带。利用圆二色谱解析胆固醇酯酶的二级结构,并测定Tm值,从最适温度、最适pH、热稳定性、pH稳定性及有机溶剂耐受性等方面对胆固醇酯酶进行研究,结果表明该酶在pH为7.0,45℃条件下表现出最大活力。     

苯系物降解菌Pseudomonas putida SW-3的筛选及其降解苯的研究

【目的】以苯、甲苯和苯乙烯为唯一碳源,从工业石油废水中筛选苯系物降解菌,分析其降解特性,探讨底物间相互作用对降解情况的影响。【方法】经生理生化和16S r RNA基因分析进行菌种鉴定,采用顶空气相色谱法测定苯系物含量,通过细胞的疏水性、乳化能力、排油圈及透射电镜观察分析菌株降解特性。【结果】经鉴定该菌为Pseudomonas putida,命名为SW-3菌株。最适降解条件下,单位菌体对苯、甲苯和苯乙烯的最大降解速率分别为0.072、0.035和0.019 g/(L·h),苯系混合物的总降解率达79.99%。底物降解实验表明,苯可促进甲苯和苯乙烯的降解,而苯乙烯则能抑制甲苯的降解。菌株的吸附、摄取和降解特性的研究发现,菌株SW-3在自身分泌的表面活性剂的协助下以耗能的方式运输苯。【结论】菌株SW-3具有产生表面活性剂和降解苯系物的能力,且底物间的相互作用能够显著影响菌株对不同底物的降解。     

生物技术知识产权的类型及其应用

全面地综述了各种类型的生物技术知识产权,包括专利、著作权、商标、技术秘密和技术标准等,以及与生物技术密切相关的行业性知识产权,如植物保护品种、新药保护等;同时对不同类型、特点、用途的知识产权进行了比较,期望对医药、工业、农业等生物技术研发机构合理地应用各种知识产权有帮助.     

利用Chlorella vulgaris C9-JN2010去除蓝藻-猪粪沼液废水中氮磷的研究

利用普通小球藻Chlorella vugaris C9-JN2010处理蓝藻-猪粪沼液废水,以实现废水无害化利用。实验考察了氮磷比和沼液浓度对小球藻生长及处理废水效果的影响,结果表明:在氮磷比(20:1)和沼液浓度(5%)条件下培养小球藻,藻细胞生长和废水处理效果最佳,最高细胞干重及生产强度分别为900.1 mg·L~(-1)和85.1 mg·L~(-1)·d~(-1),废水中总氮、总磷、氨氮的去除率分别为84.6%、95.9%和90.5%,对应去除强度分别为5.43 mg·L~(-1)·d~(-1)、0.30 mg·L~(-1)·d~(-1)和4.75 mg·L~(-1)·d~(-1)。利用小球藻可较彻底的去除蓝藻-猪粪沼液废水中氮、磷等营养,达到污水处理效果。     

巴氏醋酸杆菌对发酵中醋酸胁迫的生理应答

【目的】研究Acetobacter pasteurianus CICIM B7003对醋酸发酵形成的酸胁迫环境在细胞形态、生理、代谢方面的响应,初步提出巴氏醋杆菌的动态耐酸机制模型,为高酸度高强度液态深层醋酸发酵提供理论帮助。【方法】在9 L自吸式发酵罐中用A.pasteurianus CICIM B7003发酵醋酸,选取不同生长阶段细胞检测其荚膜多糖含量、膜不饱和脂肪酸含量、耐酸基因转录水平、乙醇呼吸链酶和ATP酶活性,研究醋酸菌形态、生理和代谢随醋酸积累的变化。【结果】醋酸的存在能减少细胞分泌荚膜多糖,发酵中多糖占细胞干重百分比由最初2.5%下降到0.89%;随发酵进行细胞膜不饱和脂肪酸占膜总脂肪酸含量显著提高,致使细胞膜流动性增加;耐酸基因相对转录水平显著提高而提升了细胞对酸性环境的抗性;乙醇呼吸链酶和ATP酶活性随醋酸积累也显著提高,为细胞提供足够的能量以满足耐酸机制对能量的需求。【结论】初步确定A.pasteurianus CICIM B7003主要依靠改变细胞膜脂肪酸组分、激活耐酸基因转录、增强乙醇呼吸链活力及快速产能等机制的协同作用,实现对酸胁迫的制衡。     

信号肽对亮氨酸脱氢酶在Bacillus subtilis中分泌表达的影响及酶学性质研究

根据信号肽N端电荷数,选择Sec及Tat两种途径的信号肽构建枯草芽孢杆菌穿梭质粒,首次实现Bacillus cereus源亮氨酸脱氢酶基因在Bacillus subtilis中的分泌表达。Tat途径信号肽Pho D促进蛋白质分泌的效果最好,胞外酶活力达20.25U/ml,为不添加信号肽的2.2倍,信号肽N端较多的电荷数,可能有利于多聚体蛋白的分泌。对表达产物进行纯化和酶学性质测定。结果表明,纯酶比酶活为13U/mg;L-Leucine为底物时酶的K_m为6.17mmol/L,V_(max)为14.49μmol/(L·min);底物特异性研究发现,酶与天然底物L-Leucine的亲和性最好,对一些脂肪族氨基酸也有活性,对芳香族氨基酸L-Phenylalanine无活性;酶的最适pH为10.5~12.0,pH稳定范围为5.0~11.0;最适反应温度为55℃;圆二色谱变温扫描酶二级结构变化,α螺旋含量随温度升高逐渐降低;差示扫描微量热技术(DSC)测定酶的解折叠温度(Tm值)为64.13℃,表明该酶具有较好耐热性。     

His-tag对胆固醇氧化酶基因在大肠杆菌中表达的影响

为考察组氨酸标签(His-tag)对Brevibacterium sp.DGCDC-82中胆固醇氧化酶基因(ChoAb)在大肠杆菌中表达的影响,将PCR扩增后得到的结构基因与pET28a(+)连接,构建重组质粒pETChoAb(不带His-tag),pETChoAbn(His-tag位于N端)和pETChoAbc(His-tag位于C端)并在大肠杆菌中进行表达.对重组酶进行酶活检测,结果表明His-tag位于ChoAb的C端和N端,COD单位体积酶活由未带标签时的1.72 U/mL分别提高到4.03 U/mL和11.36 U/mL.利用软件Quantity One对SDS-PAGE电泳条带进行灰度分析,结果显示与不带His-tag的COD相比,His-tag位于ChoAb的C端和N端,COD表达量由8.8％增加到16.4％与72.3％.同时菌体浓度分别提高了1.2倍和3.2倍.作为纯化标签,该研究结果对His-tag用于诊断用酶COD的分离纯化可以提供一定的理论指导.     

甾短杆菌胆固醇氧化酶基因在大肠杆菌中的表达

为了实现胆固醇氧化酶在大肠杆菌中的表达,将甾短杆菌Brevibacterium sp．DGCDC-82胆固醇氧化酶基因用PCR的方法去掉信号肽序列,连接到质粒pTrc99a,遗过筛选得到了表达胆固醇氧化酶的重组菌JMl09／pTrc99a—COD。经IPTG诱导后表达出相对分子质量约为5．5×10^4的蛋白质。分别考察了诱导温度、时间、IPTG浓度等因素对重组菌表达的胆固醇氧化酶的影响。在优化条件下,该胆固醇氧化酶的酶活可以达到700U／L。酶学特性分析表明其反应的最适pH为7．5,最适温度为40℃。     

耐盐硫氧化菌的筛选、鉴定及脱硫性能研究

【目的】从典型自然环境中筛选耐盐高效硫氧化菌,研究其生长特性,并进行初步脱硫实验。【方法】以硫代硫酸钠为唯一能源底物的培养基富集脱硫菌,经过3次平板划线培养、纯种分离后得到纯种培养。经过革兰氏染色、平板菌落形态观察及形态学特征研究,并结合16S rRNA基因序列分析及分子系统发育树的构建结果,确定菌株的种类。【结果】从上海外高桥某发电厂冷却水池中筛选分离出一株硫代硫酸盐去除率高、耐盐性较强的细菌,命名为CYJN-1。该菌为革兰氏阴性菌,短杆状,鉴定为那不勒斯菌(Halothiobacillus neapolitanus)。H. neapolitanus CYJN-1具有较强适应盐度变化的能力,菌株生长的盐度范围为0?5% (NaCI,质量体积比)。菌株最适生长条件为：温度30 °C、pH 7.0、底物浓度为20 g/L。在此条件下,该菌对硫代硫酸钠的去除率可达98%。【结论】H. neapolitanus CYJN-1耐盐性较强,硫代硫酸盐去除率高,在生物脱硫、生物冶金等领域都具有潜在的应用前景。