信号肽对亮氨酸脱氢酶在Bacillus subtilis中分泌表达的影响及酶学性质研究

根据信号肽N端电荷数,选择Sec及Tat两种途径的信号肽构建枯草芽孢杆菌穿梭质粒,首次实现Bacillus cereus源亮氨酸脱氢酶基因在Bacillus subtilis中的分泌表达。Tat途径信号肽Pho D促进蛋白质分泌的效果最好,胞外酶活力达20.25U/ml,为不添加信号肽的2.2倍,信号肽N端较多的电荷数,可能有利于多聚体蛋白的分泌。对表达产物进行纯化和酶学性质测定。结果表明,纯酶比酶活为13U/mg;L-Leucine为底物时酶的K_m为6.17mmol/L,V_(max)为14.49μmol/(L·min);底物特异性研究发现,酶与天然底物L-Leucine的亲和性最好,对一些脂肪族氨基酸也有活性,对芳香族氨基酸L-Phenylalanine无活性;酶的最适pH为10.5~12.0,pH稳定范围为5.0~11.0;最适反应温度为55℃;圆二色谱变温扫描酶二级结构变化,α螺旋含量随温度升高逐渐降低;差示扫描微量热技术(DSC)测定酶的解折叠温度(Tm值)为64.13℃,表明该酶具有较好耐热性。     

可吸收性止血颗粒在鼻内镜下经口腺样体吸切术中的应用

目的:探讨可吸收性止血颗粒(Arista AH)在鼻内镜下经口腺样体吸切术创面止血上的应用效果。方法:54例腺样体肥大患者行鼻内镜下经口腺样体吸切术,随机分为四组,A组20例(压迫止血后喷洒Arista AH),B组15例(压迫止血后双极电凝止血),C组7例(压迫止血后Merocel高膨胀海绵填塞),D组12例(仅压迫止血)。比较四组患者的止血时间、术后出血、咽痛持续时间、恢复正常通气时间等指标,同时采用视觉模拟评分法记录止血难度的主观评估。结果:A组手术时间、止血难度均低于B组、D组,差异具有统计学意义(P0.05),与C组无统计学差异(P0.05)。而A组术后出血发生率低于D组(P0.05),与B组、C组无统计学差异。A组咽痛持续时间低于B组、C组,差异具有统计学意义(P0.05),与D组无统计学差异(P0.05)。而A组恢复正常通气时间与B组、D组无统计学差异(P0.05)。结论:可吸收性止血颗粒可用于鼻内镜下经口腺样体吸切术创面止血,具有快速简便、安全有效的特点。     

双启动子促进亮氨酸脱氢酶在Bacillus subtilis中表达及发酵研究

为了促进亮氨酸脱氢酶在Bacillus subtilis中高效表达,采取在质粒pMA5自带的启动子P_(HpaⅡ)之后分别添加诱导型和组成型启动子,考察双启动子对酶表达的影响。选取2种诱导型启动子(P_(grac)、P_(gl-M1))和4种组成型启动子(P_(43)、P_(laps)、P_(HpaⅡ)、P_(amyQ))进行构建表达,其中组成型启动子P_(amyQ)与P_(HpaⅡ)构成的双启动子效果最好,有效地将胞外活性提高到31. 24U/ml,是单启动子PHpaⅡ的3. 4倍。在以上最优双启动子的基础上分别融合Sec途径和Tat途径的4种信号肽,但信号肽与双启动子共同作用并没有获得更高的酶活性。选用酶活最高的双启动子突变菌株Bacillus subtilis168/pW6(P_(HpaⅡ)-P_(amyQ))进行7. 5L发酵罐补料发酵产酶研究,LeuDH酶活达到217. 96U/ml,是摇瓶水平的6. 97倍,对工业上产亮氨酸脱氢酶有一定参考价值。     

抗IL-6抗体治疗小鼠变应性鼻炎的作用的研究

目的：探讨IL-6 抗体治疗小鼠变应性鼻炎的作用。方法：实验动物分三组：PBS 组（正常对照组）、抗IL-6 抗体组（以抗IL-6 单 克隆抗体处理）、IgG 抗体对照组（以IgG对照抗体处理）。应用卵清蛋白（OVA）致敏建立小鼠变应性鼻炎模型,给予抗IL-6 单克 隆抗体干预,计量抗原激发后小鼠搔鼻数量。应用HE染色方法检测对小鼠鼻黏膜炎症影响,应用ELISA 法检测小鼠灌洗液中 IL-4、IFN-r含量。结果：治疗后抗IL-6 抗体组小鼠搔鼻症状相对于抗体对照组明显减轻（P<0.01)。与PBS 组比较,IgG 抗体对照组 小鼠鼻腔灌洗液中总炎性细胞数,淋巴细胞数及嗜酸性粒细胞数明显升高（P<0.05);IL-6 抗体治疗后,小鼠鼻腔灌洗液中总炎性 细胞数,淋巴细胞数及嗜酸性粒细胞数明显降低（P<0.05);IgG抗体对照组小鼠鼻腔灌洗液IL-4 含量明显升高（P<0.01),而IFN-r 含量不变（P>0.05);IL-6 抗体治疗后,IL-4 含量较IgG 抗体对照组降低（P<0.05),IFN-r含量不变（P>0.05)。结论：IL-6 抗体可有效 治疗小鼠变应性鼻炎。     

采用TOPOTA克隆技术构建人CC10质粒并在BEAS-2B细胞中的表达

目的:采用TOPO TA克隆技术构建及鉴定人CC10基因表达载体,并在支气管上皮细胞系BEAS-2B细胞中获得稳定表达,初步探讨CC10在呼吸道上皮细胞炎症反应中的作用。方法:提取人下鼻甲组织的总RNA,逆转录反应生成c DNA,再用PCR方法扩增出含人CC10编码区全长的DNA片段,将PCR产物直接连接到pc DNA3.1/V5-His TOPO TA载体中,转化至大肠杆菌后经筛选鉴定出CC10表达载体,用脂质体法将CC10质粒转染到BEAS-2B,细胞免疫荧光法检测CC10蛋白的表达。随后用促炎细胞因子IL-1β刺激转染空质粒和CC10质粒的BEAS-2B细胞,用实时定量RT-PCR和ELISA检测炎性趋化因子RANTES m RNA和蛋白的表达。结果:目的基因与TOPO TA载体在室温下5 min的连接反应效率91.7%,用酶切法鉴定质粒并测序,人CC10基因成功克隆到真核细胞表达载体pc DNA3.1中,CC10蛋白在BEAS-2B细胞中无表达,但在体外转染CC10质粒后CC10蛋白表达明显增高。转染CC10质粒的BEAS-2B细胞可抑制IL-1β诱导的RANTES m RNA和蛋白的表达。结论:利用TOPO TA克隆技术可高效、快速的构建人CC10基因表达载体,并能够在BEAS-2B细胞中获得稳定表达,CC10蛋白在呼吸道上皮细胞中可发挥抗炎作用。     

肠道病毒B家族埃可病毒16（E16）型的病毒样颗粒的结构解析

肠道病毒B家族是引发人类病毒性脑炎和脑膜炎的重要病原体之一. 然而目前市场上尚缺乏针对此类病毒的特异性疫苗. 病毒样颗粒具有保留病毒真实结构特点、不含病毒核酸、不具备病毒复制与感染能力的特征，为开发有效、稳定且安全的新型疫苗提供了理想方案，特别是针对无囊膜的肠道病毒. 本研究中，我们基于昆虫细胞表达系统，经密度梯度离心等方法获得了埃可病毒16（E16）型的病毒样颗粒（virus-like particle; VLP）. 借助冷冻电镜单颗粒技术，我们成功将该病毒VLP解析到原子分辨率（2.8 ?），结构分析显示：与同源病毒E30的结构相类似，E16-VLP具备肠道病毒所特有的能够引起机体产生特异性中和免疫反应的重要结构特征，具有较大的疫苗开发价值. 我们所建立的方法在抗肠道病毒B家族通用疫苗的设计与开发上具有巨大潜力.