热休克蛋白27在转移潜能不同人肝癌细胞系中的表达及机制研究

利用不同转移潜能肝癌细胞系探讨热休克蛋白27(HSP27)参与肝癌细胞转移潜能形成的可能分子机制.细胞免疫荧光技术、RT-PCR和免疫印迹技术显示,HSP27在转移潜能不同的肝癌细胞Hep3B、MHCC97L和MHCC97H中定位于细胞浆,亦可见于细胞核,HSP27 mRNA和蛋白质的表达水平与肝癌细胞转移潜能呈正相关.高转移潜能肝癌细胞系MHCC97H的HSP27 RNA干扰试验结果显示,HSP27 RNA干扰后MHCC97H的侵袭(MHCC97H组:21.36±2.92;对照RNAi组:19.88±2.23;RNAi组:11.40±2.05)、运动能力(MHCC97H组:26.35±3.29;对照RNAi组:24.43±3.17;RNAi组:10.92±2.27)明显减弱,细胞凋亡显著增加(MHCC97H组:15.12%;对照RNAi组:17.56%;RNAi组:27.64%).同时进行信号转导基因芯片检测发现,HSP27干扰后核因子κB(NF-κB)通路抑制,并且免疫印迹显示细胞核内活化的NF-κBp65减少,细胞内磷酸化IκBα降低.另外,免疫共沉淀检测发现,在肝癌细胞内HSP27可与IKKβ、IκBα共沉淀,且在HSP27RNA干扰后IKKβ与IKKα结合能力下降.这些结果提示,HSP27可能通过参与细胞内NF-κB通路的激活,影响细胞凋亡和细胞运动,在肝癌细胞侵袭转移过程中发挥作用.     

人健康肝组织核心岩藻糖基化蛋白质的鉴定及生物信息学分析

糖蛋白质组学方法鉴定人健康肝组织核心岩藻糖基化蛋白质,将有助于发现肝癌、慢性肝病相关异常核心岩藻糖基化蛋白质.应用凝集素亲和层析技术、双向电泳(2-DE)联合基质辅助激光解吸飞行时间串联质谱(MALDI-TOF-MS/MS)分析,建立人健康肝组织核心岩藻糖基化蛋白表达谱,图谱均点数为(130±3)个,挖取90个蛋白质点进行质谱鉴定,数据库搜索及去冗余后,共鉴定53种蛋白质,主要分布于pI5～9,分子质量为10～100ku区域处.Gene Ontology分类发现它们参与体内代谢等过程,应用NetNGlyc对它们进行糖基化位点预测,并通过蛋白质免疫沉淀联合凝集素亲和印迹对其中的结合珠蛋白前体,α烯醇化酶的核心岩藻糖基化进行了再验证.以上结果提示,凝集素层析、2-DE联合MALDI-TOF-MS/MS分析是一种鉴定某种特定类型糖蛋白的高通量检测方法,所建立的表达谱可用于发现疾病发生、发展中相关的异常核心岩藻糖基化蛋白质.     

评价新型稳定同位素赖氨酸标记在定量蛋白质组学中的应用

为了评价基于2-甲氧基-4,5-二氢-1氢-咪唑稳定同位素试剂在定量蛋白质组学中的应用价值,合成了轻型(D0)和重型(D4)的2-甲氧基-4,5-二氢-1氢-咪唑,通过对标准蛋白BSA酶解后产物的标记确认标记反应的特异性,并观察了标记物在MALDI-TOF-MS和LC-ESI-MS中定量的准确性,标记肽在串联质谱中的离子特点,以及对反相液相色谱行为的影响。结果表明,2-甲氧基-4,5-二氢-1氢-咪唑只与酶解后的肽段赖氨酸侧链氨基反应,具有良好的标记特异性;差异表达蛋白的定量可以通过MALDI和ESI电离模式实现;标记肽的串联质谱主要产生y离子,测序更为简便;反相液相色谱可以保持较好的分离效果,氘原子的引入不会影响保留时间,侧链修饰可以用于涉及液相色谱分离的蛋白质组学技术。2-甲氧基-4,5-二氢-1氢-咪唑稳定同位素试剂可以用于定量蛋白质组学。     

傅里叶变换红外光谱分析NMDA受体单克隆抗体抗兴奋毒损伤机理

人N-甲基-D-门冬氨酸受体（NMDAR,NR）单克隆抗体MABN1具有明确的抗兴奋毒保护作用,但其机制不明.以MABN1和MK-801分别预处理海马细胞,拮抗谷氨酸兴奋毒损伤作用,采用傅里叶变换红外光谱（FTIR）技术,对不同处理后的海马细胞红外光谱特性进行比较.将去卷积的酰胺Ⅰ带进行曲线拟合后发现,MABN1组与MK-801组的蛋白质二级结构有明显不同,提示二者在抗兴奋毒机制方面存在差别.     

噬菌体肽库中筛选NMDA受体抗原表位

为了获得人N-甲基-D-天冬氨酸受体（NR）主亚基（NR1）M3-M4环B细胞表位,以人NR1分子M3-M4环单克隆抗体MAB363淘筛噬菌体展示随机12肽库,对筛选克隆进行特异性ELISA检测和竞争结合实验分析.从30个克隆中得到一个阳性克隆序列“VHTNPSTWQPIL”（克隆1）,原核表达的NR1 M3-M4环可以与克隆1竞争结合MAB363.固相合成5个表位探针短肽,发现其中只有R(22)LRNPSKD可以与M3-M4环竞争结合抗体,将NPS三个氨基酸残基逐一敲除,缺失N或NP的合成肽和M3-M4环竞争抗体的能力减弱,缺失NPS的合成肽完全没有竞争能力,证明MAB363的表位为NPS,S可能是关键性残基.上述结论为免疫干预防治兴奋毒性脑损害策略的实施提供了一个重要线索和依据.     

基于凝集素芯片的不同转移潜能肝癌细胞膜蛋白糖谱比较

评估采用凝集素芯片技术寻找肝癌细胞表面侵袭和转移相关特征性糖谱的适用性．首先选取一对模式细胞株(中华仓鼠卵巢细胞CHO和其N-乙酰葡萄糖胺转移酶Ⅰ缺陷株Lec1)验证凝集素芯片系统的可靠性．然后通过凝集素芯片比较正常肝细胞L02、非转移肝癌细胞Hep3B、高转移肝癌细胞HCCLM3的细胞表面糖谱,同时采用细胞凝集素组织化学的方法验证芯片结果．细胞Hep3B和L02相比,对凝集素PHA-L、ConA、AAL、MPL的亲和作用增强而对凝集素WGA的亲和作用减弱,提示在肝癌细胞表面可能出现了增多的复杂寡糖分支、高甘露糖、末端岩藻糖、黏蛋白T抗原和减少的N-乙酰葡萄糖胺和/或多价唾液酸结构．细胞HCCLM3和Hep3B相比,对凝集素LCA、MAL-Ⅰ、MAL-Ⅱ、WGA、PHA-E的亲和作用增强而对凝集素RCA-I的亲和作用减弱,提示在高转移肝癌细胞HCCLM3的表面可能出现了增多的核心岩藻糖、唾液酸(主要是α2-3链接方式)、N-乙酰葡萄糖胺、平分型GlcNAc结构以及减少的末端β1-4链接半乳糖结构．细胞凝集素组织化学的结果支持芯片结果．研究证明,凝集素芯片技术是解析生物学进程中糖谱改变的适用工具．