一种多基因串联共表达载体的构建

为了构建一种可用于串联共表达多个基因的原核表达载体,通过PCR引入点突变,对商业载体pET-22b的酶切位点进行定向改造,设计独特的XbaⅠ/SpeⅠ模块。获得改造成功的载体pET-m22b,测序结果显示启动子、核糖体结合位点、多克隆位点及终止子均位于XbaⅠ和SpeⅠ两酶切位点间。选取不同来源的基因进行串联组合及表达鉴定,四个基因成功组合于同一载体中,表达效果良好,各基因表达效率不受明显影响。研究构建的载体pET-m22b,使多基因的共表达更加便捷,为蛋白复合物的表达与纯化、代谢通路的异源重建及其优化等研究奠定了良好的基础。     

红霉素大环内酯合成通路在大肠杆菌中的重建

研究在大肠杆菌中重建了红霉素大环内酯(6-脱氧-红霉内酯B,6dEB)合成通路。先将参与6dEB合成所必需的基因分别克隆于多基因串联共表达载体中,获得单基因重组质粒;再利用载体中XbaⅠ/SpeⅠ互为同尾酶的特性实现相关基因的串联组合,获得多基因重组质粒pBJ130和pBJ144。将多基因重组质粒共转化BAP1,获得含6dEB合成通路的工程菌株BAP1(pBJ130/pBJ144),SDS-PAGE检测结果显示通路中各基因均有明显的表达;进行低温发酵,产物粗提后质谱检测到6dEB,其产量约10 mg/L。表明成功实现了6dEB合成通路在大肠杆菌中的重建,为红霉素大环内酯的改造和修饰提供了平台,也为红霉素合成通路在大肠杆菌中的完整重建以及聚酮类抗生素的组合性生物合成提供了参考。     

抗血管生成蛋白与多肽研究进展

多项动物实验和临床实啦已经充分证实,抗血管生成疗法可以抑制肿瘤生长。在可抑制肿瘤生长的分子中,许多是蛋白与多肽,包括细胞因子、趋化因子、血管内皮生长因子及其受体的抗体、可溶性受体、胞外基质蛋白片段及小分子合成多肽等。简要综述其中部分分子的作用机理及临床应用情况。     

在鸡胚绒毛尿囊膜上评价血管生成技术的应用与优化

目的：用鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）评价血管生成并进行优化,为抗血管生成药物筛选提供良好的体内实验模型。方法：对CAM技术的各个环节,包括合适日龄胚蛋选择、蛋壳开窗及暴露CAM的方法、载体选择、结果分析等进行了实验对比。结果：采取气室开窗,以甲基纤维素为药物载体,促进血管生成的药物在孵化11d以后、抑制血管生成的药物在孵化7～9d给药,鸡胚存活率为85.8%,生长状况良好,被检测药物有明显的抑制或促进血管生成的效应。结论：通过优化建立了操作简便、鸡胚存活率高的在CAM上评价血管生成的技术;应用CAM技术评价了若干影响血管生成的因子。     

应用荧光原位杂交技术检测康柏西普基因在CHO细胞染色体上的整合状态

CHO细胞是常用的哺乳动物表达工程细胞。外源基因整合至CHO细胞染色体后,在大规模蛋白质生产过程中,由于相关压力撤除,外源基因存在丢失的可能,因此有必要对其整合稳定性进行检测。康柏西普(conbercept)是一个能够特异性结合VEGF-A的各种异构体、VEGF-B以及PlGF,从而发挥抗血管生成活性的融合蛋白。康柏西普目前已在美国进入Ⅲ期临床试验。本文运用荧光原位杂交对康柏西普基因在CHO细胞的整合状态进行了检测,发现经过4和19次传代后,康柏西普基因依然能稳定整合在基因组上,并且呈现出3个特点：(1)分布在一条染色体上,而不是多条染色体上;(2)分布在较长的染色体上;(3)在同一染色体上有较多拷贝数。同时,荧光定量PCR结果证明基因拷贝数无明显改变,ELISA检测证明蛋白表达水平亦无明显改变。上述实验证明在经过19次传代以后,康柏西普基因仍然稳定整合在基因组中,并可活跃表达,为康柏西普大规模生产及产品质控提供了有力依据。     

超声处理导致交联DNA序列特异性断裂

目的:研究在交联状态下超声方法处理DNA是否导致DNA随机断裂。方法:通过建立一种新的Clone-Sequencing筛选技术,利用NCBI等相关网站,结合Vector-NTI等软件分析得到不同断裂位点的核苷酸序列,利用SPSS 18.0软件,对不同断裂位点核苷酸序列的分布进行统计学分析。结果:利用Clone-Sequencing技术得到216个来源于不同染色体位置的克隆片段,通过对其正义链和反义链的5’-DNA断裂末端的分析,得到432个超声断裂位点的核苷酸序列信息。对断裂位点核苷酸序列进行统计分析发现,超声处理后,交联DNA的断裂位点并不像过去认为的完全随机分布,而是存在明显的偏性,即对于所有16种不同的二核苷酸组合,超声处理导致交联DNA更易在5’-ApN-3’寡核苷酸中间的磷酸二酯键处断裂,且其相对断裂频率呈现d(ApN)>>d(GpN)>d(CpN)>d(TpN)的趋势。结论:传统的超声方法处理,交联DNA断裂位点并不是完全随机分布,而是存在着明显的序列偏好性,这一新发现提示,对于目前广泛使用的、涉及交联DNA超声处理的ChIP-Chip或ChIP-Seq等高通量及其衍生技术结果的统计分析,需要引入更加合理有效的分析策略。     

基于荧光强度快速判断蛋白可溶性方法的建立

目的:建立一种通过观察荧光强度,快速、直观地判断蛋白可溶性的方法。方法:选择抗辐射蛋白CBL502-AA及其突变体CBL502-ΔAA′作为目的蛋白,增强型绿色荧光蛋白作为报告分子,分别构建融合蛋白表达载体;通过SDS-PAGE和荧光观察两种手段检测和比较融合蛋白的可溶性。结果:荧光观察融合蛋白的可溶性与SDS-PAGE检测结果一致。结论:建立了一种基于荧光强度,快速、简单、直观的比较蛋白可溶性的方法。     

利用CRISPR/Cas9技术构建CTCF蛋白降解细胞系

CTCF是脊椎动物关键的绝缘子蛋白,在细胞生命过程中发挥重要作用,敲除CTCF基因会导致小鼠胚胎死亡。为进一步探讨CTCF的功能,本文利用CRISPR/Cas9介导的同源重组,在内源性CTCF表达框上游敲入一个有丝分裂期降解结构域(Mitosis-special degradation domain, MD),该结构域可以带动CTCF融合蛋白在M期降解。作为对照,将MD结构域的第42位的精氨酸突变为丙氨酸,形成无降解活性的MD^*,可使MD^*-CTCF融合蛋白始终稳定存在。将嘌呤霉素与融合蛋白同时表达,即可利用抗生素筛选,高效地筛选到纯合克隆。利用蛋白印迹技术和免疫荧光检测3种细胞在不同细胞周期的CTCF蛋白变化情况,发现MD-CTCF细胞系CTCF蛋白含量约为野生型细胞的10%,MD^*-CTCF细胞系的CTCF含量与野生型没有显著差别;通过流式细胞术观测降解CTCF对细胞的影响,发现MD-CTCF细胞系G1期明显延长。总之,利用CRISPR/Cas9技术在CTCF表达框上游高效地插入MD,首个CTCF特异性降解的人类细胞系获得成功构建。     

核基质附着区广泛参与基因组三维结构折叠的生物信息学分析

在细胞分裂间期,每条染色质都占据着特定的染色质领域（chromosome territory,CT）。每个CT领域内进一步分成不同的拓扑学相关区域（topological associated domain,TAD）,每个TAD又由若干子TAD（sub-TAD）构成。不同的TAD相互聚集,形成基因活跃表达和不表达的A、B两种组份或区室（compartment）。然而,目前对于染色质折叠方式及维持机制的研究尚无定论。核基质附着区（matrix attachment regions,MARs）是在不同物种基因组中广泛存在的一类富含AT序列的与核基质结合的DNA元件,能够通过与CTCF、SATB1等调控蛋白质相互作用,对远距离的基因表达进行调控。本研究以染色质三维结构为背景,通过整合染色质三维结构及组蛋白修饰等组学数据,对MARs元件与染色质三维结构的关系进行研究,对MARs元件参与形成的相互作用网络的结构及功能进行探索。结果发现,MARs元件与染色质三维结构高度相关,而且在高强度相互作用中占据较大的比例,提示MARs元件在染色质折叠方面发挥作用。此外,通过拓扑结构聚类分析还首次揭示,MARs元件分为不同类型,包括维持染色质领域及空间构象等的结构单元部分,以及调控基因表达等的功能单元部分。这表明,MARs元件在基因组三维高级结构的建立、维持以及功能等方面发挥重要作用。     

全基因组染色质相互作用Hi-C文库制备的优化及其质量控制

Hi-C(highest-throughput chromosome conformation capture)技术是近年出现的一种研究染色质相互作用的关键技术。该技术步骤多、耗时长,涉及的试剂耗材繁杂,目前常规流程还有较多可以改进优化的步骤。本研究以GM12878细胞为材料,通过优化常规Hi-C实验中的交联、酶切、限制性内切酶的失活、末端生物素标记、原位连接等关键步骤,建立了稳健的Hi-C流程,制备了相应的Hi-C文库。文库经初步的Sanger测序等质量控制以后,两个生物学重复文库进行了高通量测序。测序结果利用生物信息学处理发现：原始测序数据中可比对率和配对率分别达到90%和72%左右。此外,去除自连片段(self-circular ligation)和dangling-ends片段以后,可获得超过96%的有效相互作用对,其中染色体内相互作用数据达到60%。进一步的染色体相互作用热图分析可见清晰拓扑学相关结构域TADs(topologically associated domains),与已发表的文献报道一致。而两次生物学重复之间的相关性分析则表明bin coverage和all bin pairs的相关性都极强。上述结果表明通过对常规Hi-C流程关键步骤的优化,本研究建立了高效、稳健、可靠的Hi-C流程,对Hi-C技术的进一步使用与推广具有重要的参考价值。