嗜水气单胞菌TPS-30株丝氨酸蛋白酶基因与溶血素基因在大肠杆菌中的融合表达

嗜水气单胞菌丝氨酸蛋白酶和溶血素是该菌重要的致病因子与保护性抗原。致病性嗜水气单胞菌TPS-30株为江浙一带鱼类暴发病病原主要血清型O:9的代表株。研究利用PCR方法扩增嗜水气单胞菌TPS-30株的丝氨酸蛋白酶基因(Spe)和溶血素基因(Hly),将基因Spe和Hly通过柔性片段进行融合,并将融合片段插入pET32a的多克隆位点,构建成重组融合表达载体pET32a-Spe-Hly。将重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经异丙醛-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,获得融合蛋白Spe-Hly。表达产物经SDS-PAGE检测,显示与预期大小约130kD相吻合的融合蛋白带。纯化融合蛋白并对鲫鱼进行免疫攻毒试验。结果表明,丝氨酸蛋白酶基因和溶血素基因融合表达载体构建成功,并成功获得了融合蛋白Spe-Hly,对鲫鱼的免疫保护率达81.4%。这为基因工程亚单位多价疫苗的开发提供基础。       

大黄鱼病原哈维氏弧菌单克隆抗体的制备及其应用

用甲醛灭活哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）GYC1108-1制备免疫原免疫8周龄雌性BALB/c小鼠,利用淋巴细胞杂交瘤技术,用间接酶联免疫吸附试验（ELISA）对杂交瘤进行筛选,阳性克隆经2－3次亚克隆后,共获得5株针对GYC1108-1的单克隆抗体。选取1B7制备小鼠腹水抗体,其细胞上清及腹水效价分别为1∶3200和1∶32000。同样用灭活的哈维氏弧菌免疫新西兰大白兔,5次免疫后颈动脉采血,离心取血清,并用饱和硫酸铵法进行纯化,制备了兔抗哈维氏弧菌多克隆抗体,其ELISA效价为1∶51200。利用1B7单克隆抗体和兔抗哈维氏弧菌多克隆抗体以及山羊抗小鼠HRP酶标二抗,建立了检测哈维氏弧菌的三抗体夹心酶联免疫吸附试验（TAS-ELISA）方法。该方法对哈维氏弧菌的最小检出浓度为1×104个/mL。用该TAS-ELISA方法检测大黄鱼（Pseudosciaena crocea）样品,54尾患病大黄鱼中有45尾检出哈维氏弧菌,而14尾健康大黄鱼都没有检出哈维氏弧菌。由此可见,本试验建立的TAS-ELISA方法,可以用于患病大黄鱼哈维氏弧菌的快速诊断。     

青虾“软壳综合症”病原及其特性

从患软壳综合症的濒死青虾体内分离到一株细菌QXL0711B, 经人工感染试验, 其对青虾的半数致死浓度(LC50)为1.47×106 CFU/mL, 具有较强毒力。API 32E系统鉴定及16S rRNA序列分析, 该病原菌为维罗纳气单胞菌温和生物变种(Aeromonas veronii biovar sobria, 登录号: FJ808727)。其系统发育分析表明, 菌株QXL0711B与维罗纳气单胞菌(登录号: X71120)和维罗纳气单胞菌温和生物变种(登录号: AY987729)的亲缘关系最近,     

中华鳖源致病性产吲哚金黄杆菌分离、鉴定及药敏特性分析

对患病中华鳖(Pelodiscus sinensis)进行病原分离、鉴定及药敏实验, 从患病中华鳖皮肤、肝肾脾重要器官分离纯化病原菌, 经理化特性测定及16S rRNA序列分析对其进行鉴定及人工感染试验, 并利用K-B及二倍稀释法进行药敏特性分析。结果表明分离株J22是为中华鳖腐皮病病原, 其对中华鳖的LD₅₀为3.30×104 CFU/g。J22株理化特性与产吲哚金黄杆菌(Chryseobacterium indologenes)一致, 16S rRNA序列与产吲哚金黄杆菌同源性为99%, 综合判定J22株是产吲哚金黄杆菌。分离株对新霉素、庆大霉素及阿莫西林等12种抗生素高度敏感, 对氟苯尼考及多西环素等抗生素耐药; 二氧化氯、漂白粉及高铁酸钾对分离株消毒效果较好。分离菌株J22是中华鳖病原菌, 养殖时可选用庆大霉素、新霉素或者阿莫西林内服, 配合使用二氧化氯、漂白粉及高铁酸钾等外用进行防控。     

海南罗非鱼无乳链球菌分离鉴定及其特性研究

从海南省患暴发性疾病的罗非鱼(Tilapia)上分离出1株细菌HNLFYL4,对分离菌株进行了鉴定及致病性和药物敏感性研究.通过形态学观察和生理生化鉴定,结果显示,分离菌株为无乳链球菌(Streptococcus agalactiae).对分离菌株的16S rRNA基因进行PCR扩增和测序,所得序列已登录到GenBank,登录号为HQ645983,与GenBank中收录的链球菌16S rRNA 基因进行比对并构建系统进化树,结果表明,分离菌株的16S rRNA基因序列与无乳链球菌同源性高达100%,进一步确定分离菌株为无乳链球菌.人工感染显示分离菌株对小白鼠和罗非鱼均具有致病性,对小白鼠的LD50为1.0×104 CFU/mL,对体重为500g±20g的罗非鱼的LD50为1.729×109CFU/mL.分离菌株对氯霉素、青霉素G、呋喃妥因等敏感,对丁胺卡那、链霉素、卡那霉素等不敏感.     

哈维氏弧菌胞外蛋白酶基因的表型克隆与序列分析

哈维氏弧菌是引起大黄鱼疾病的主要致病菌之一,胞外蛋白酶是哈维氏弧菌GYC1108-1的主要致病因子。利用表型克隆技术,用Sau3AⅠ将提取的哈维氏弧菌基因组DNA酶切成短片段,纯化回收1-5 kb的片段与BamH I酶切的pUC118在T4连接酶的作用下进行连接,并转化感受态细胞TG1,在含0.5%脱脂奶和100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上筛选胞外蛋白酶阳性株,命名为YZ。测定阳性株YZ的胞外蛋白酶活性,并对阳性株的重组质粒的插入片段进行序列测定,分析开放阅读框,确定胞外蛋白酶基因编码区。发现蛋白酶基因的ORF编码531个氨基酸,在起始密码子ATG上游存在一个核糖体结合位点(SD),其上游的启动区与大肠杆菌的σ70启动区和枯草芽孢杆菌的启动区高度同源。在终止子(TAG)下游,存在两个反向重复序列,为推导的2个转录终止子。哈维氏弧菌胞外蛋白酶基因的克隆与诠释为哈维氏弧菌致病机理和疫苗的开发奠定了基础。     

siRNA干扰对鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF57基因表达的影响

研究通过在异育银鲫脊髓细胞系(Spinal cord tissue cell lines of Carassius auratus gibelio, CSC)中对鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2, CyHV-2) ORF57进行RNA干扰, 以探究其对CyHV-2病毒复制的影响。首先, 以FAM标记的异育银鲫β-actin的siRNA进行CSC细胞转染条件的优化, 再将针对CyHV-2 ORF57基因设计的3条siRNA, 转染CSC细胞, 并进行病毒感染, 评估siRNA对病毒复制和致细胞病变的影响。转染条件优化结果显示, 在siRNA浓度为80 nmol/L, 转染液维持24h后更换维持液, β-actin基因表达量最低且观察到的荧光点数量最多。而ORF57-siRNAs干扰结果显示, ORF57-siRNA-2组表现出了较强的抑制效果, 在接毒48h时, ORF57-siRNA-2处理组的ORF57基因表达量降到相对于Mock组的33.55% (P<0.01), 并且各ORF57-siRNA组都表现出了延缓CyHV-2致细胞病变的时间和强度, 抑制时间可达120h。TCID₅₀结果显示, 不同组的ORF57-siRNAs均能降低病毒滴度, 其中ORF57-siRNA-2将病毒原液TCID₅₀ 108.487/mL下降至106.776/mL。研究结果表明, 干扰ORF57的表达可大大降低CyHV-2的致细胞病变力和复制率, ORF57在CyHV-2复制与致细胞病变中起重要作用。本研究为CyHV-2基于siRNA技术的抗病毒治疗和弱毒株的改造提供了借鉴。     

罗氏沼虾主要病害研究概况

罗氏沼虾是一种重要的经济水产动物,目前在世界各地均有大规模的养殖,尤其集中于东南亚地区,随着养殖规模的扩大其病害发生也越来越多,给罗氏沼虾养殖行业带来了巨大的损失。总结了近年来国内外关于罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)主要疾病及防治方面的研究成果,按照病原的不同分为寄生虫疾病、细菌性疾病、病毒性疾病,主要围绕上述几类疾病的研究及防治的工作展开论述,为今后罗氏沼虾的病害防治提供依据。     

致病性维罗纳气单胞菌检测方法的建立

发掘维罗纳气单胞菌特异性更强的检测靶点和毒力相关基因靶点,建立能够检测致病性维罗纳气单胞菌的PCR检测方法.通过序列比对分析气单胞菌的16S rRNA基因序列,筛选对维罗纳气单胞菌特异的引物,用于检测种特异性,利用气单胞菌气溶素基因保守引物,检测菌株的致病性,并进行反应条件和反应体系的优化,灵敏度试验和特异性试验.发掘并设计的维罗纳气单胞菌16S rRNA特异性引物结合气单胞菌气溶素基因保守引物建立的检测方法,对12株气单胞菌和10株非气单胞菌的检测结果显示,所有致病性维罗纳气单胞菌都能扩增到大小分别为343 bp和232 bp的特异性条带,而非维罗纳气单胞菌的致病性气单胞菌只能扩增到232 bp的气溶素基因特异性条带,其它菌株都不能扩增到目的条带.灵敏度试验表明,该反应体系的检测灵敏度为1.35×10-3 mg/L.我们建立的致病性维罗纳气单胞菌检测方法能特异地检测致病性维罗纳气单胞菌,并具有高度灵敏性.     

嗜水气单胞菌对喹诺酮类药物耐药的分子机制

【目的】调查从浙、苏、皖等地水产动物中分离的23株致病性嗜水气单胞菌的耐药谱并探索喹诺酮类抗生素耐药菌株的耐药分子机制。【方法】根据美国临床实验室标准化协会药敏判断标准(2011版)测定23株嗜水气单胞菌耐药谱并筛选喹诺酮类抗生素耐药株;对筛选的耐药菌株和体外诱导耐药菌株的gyrA和parC基因耐药决定区进行分析;用二倍稀释法测定加入多重耐药外排泵抑制剂碳酰氰基-对-氯苯腙前后耐药菌株对恩诺沙星最小抑菌浓度的变化,同时检测喹诺酮类药物相关的外排泵基因qepA、oqxA和mdfA;并检测质粒介导的喹诺酮耐药的qnr家族基因qnrA、qnrB、qnrC、qnrD和qnrS。【结果】所有菌株都存在对5种以上药物的耐药性;39.1%(9/23)的嗜水气单胞菌对喹诺酮类药物耐药,其中55.6%(5/9)对恩诺沙星耐药。耐恩诺沙星的5株菌株均携带qnrS,而不携带qnrA、qnrB、qnrC、qnrD基因,也不携带外排泵基因qepA、oqxA和mdfA。其中耐药菌株AH19同时存在gyrA与parC基因双突变、质粒介导的耐药基因qnrS和主动外排泵三种耐药机制,菌株AH4、AH7和AH20存在gyrA与parC基因双突变和质粒介导的耐药基因qnrS两种耐药机制,AH6存在gyrA基因突变和质粒介导的耐药基因qnrS机制,体外诱导耐药菌株ATCC7966-QR相对于原始菌株ATCC7966发生了gyrA与parC基因双突变。【结论】喹诺酮类药物作用靶位的改变和质粒介导的耐药基因qnrS的存在是本研究中涉及的嗜水气单胞菌对喹诺酮类药物耐药的主要作用机制,主动外排泵机制是个别菌株存在的耐药机制。