水稻YTB中OSVDAC5蛋白的原核表达与抗体制备

目的:克隆水稻YTB osvdac5基因,原核表达后获得纯化的OSVDAC5蛋白,制备相应的抗体.方法:采用Trizol法提取水稻总mRNA,反转录为cDNA,通过PCR扩增得到该基因与原核表达载体连接,构建重组质粒pET-30a-osvdac5,并转入大肠杆菌进行原核表达,SDS-PAGE检测表达产物.通过镍柱纯化获得的单一目的蛋白用于抗体制备,用Western Blot检测抗体的特异性.结果:克隆到原核表达载体中osvdac5基因的ORF为813 bp,编码271个氨基酸.在大肠杆菌中15℃、0.7mmol/L的IPTG浓度诱导17 h是pET-30a-osvdac5融合蛋白表达的优选条件,表达的OSVDAC5蛋白属于包涵体蛋白.镍柱纯化后的OSVDAC5为30 kD左右的单一条带.Western Blot分析表明,抗体能够与30 kD处的OSVDAC5蛋白进行特异性结合.结论:成功克隆了水稻YTB osvdac5基因,原核表达蛋白OSVDAC5制备的多免隆抗体具有一定特异性,能与免疫抗原结合,这为进一步研究OSVDAC5蛋白在植物不同生长发育时期中的表达模式奠定了基础.     

人健康肝组织刀豆凝集素(Con A)结合型糖蛋白组学研究

通过凝集素亲和层析技术结合双向电泳-质谱技术构建人健康肝组织Con A结合型糖蛋白数据库并进行生物信息学分析; 利用研磨和匀浆两步法抽提人健康肝组织总蛋白, 通过固相凝集素亲和层析获得与刀豆凝集素(Con A)结合型糖蛋白, 经过双向电泳、荧光染色、图像分析获得人健康肝组织表达谱; 通过MALDI-TOF-MS质谱鉴定及生物信息学分析获得人健康肝组织数据库, 并建立了高重复性的人健康肝组织Con A结合型糖蛋白表达谱, 图谱均点数为301±15, 挖取139个蛋白点进行质谱鉴定, 去冗余后确定了85个与细胞周期、代谢通路相关的蛋白质; 通 过NetNGlyc和NetOGlyc对糖基化位点进行预测, 并按照geneontology对其功能定位等进行分类, 并对其中与肿瘤发生发展相关的蛋白进行具体分析. 由此可见, 凝集素亲和层析结合2－DE, 质谱鉴定是一种高通量的检测方法, Con A结合型糖基化修饰谱的构建为后续研究奠定了基础.     

阴道假丝酵母菌病患者混合UU/CT感染的初步研究

目的 对女性下生殖道假丝酵母菌感染患者进行解脲脲原体(UU)和沙眼衣原体(CT)检测,以了解女性下生殖道假丝酵母菌感染患者中UU/CT的混合感染状况,为临床正确诊断和治疗提供依据.方法 对以外阴瘙痒及白带增多为主诉,拟下生殖道假丝酵母菌感染的女性患者进行临床检查,先取阴道分泌物进行假丝酵母菌检查,同时取宫颈管分泌物采用荧光定量PCR测定UU、CT.结果 在90例假丝酵母菌感染的患者中,UU阳性71例占78.89%,CT阳性14例占15.56%(其中11例同时存在UU阳性,占78.57%),均较对照组(分别为41.2%和7.2%)明显升高,差异有显著性,P<0.05.结论 女性下生殖道假丝酵母菌感染患者存在合并UU和(或)CT感染,有必要进行常规的检查,以便正确使用有效药物治疗.     

应用实时定量RT-PCR技术检测b地中海贫血 珠蛋白基因的表达

为了定量检测 b 地中海贫血(b 地贫)的 a、b 和γ珠蛋白基因表达水平, 提取正常成人对照组、正常胎儿对照组和b 地贫患者组组成的样本 DNA,采用反向点杂交法（RDB）分析b 地贫各种突变类型;提取样本RNA用于进行针对a、b 和γ珠蛋白基因的荧光实时定量RT-PCR（FQ RT-PCR）。根据FQ RT-PCR原理,设计合成分别对应于a、b 和γ珠蛋白基因的3对引物和3条荧光探针,FQ RT-PCR在ABI 7700系统进行。用SPSS 10.0对实验数据进行统计学分析,分别计算正常对照组 (bA/bA,aa/aa),脐带血组(bA/bA,aa/aa),轻型b 地贫组(bT/bA,aa/aa),重型b地贫组(bT/bT,aa/aa)的a、b 和γmRNA比值,其中a/b分别为4.62±1.20、7.81±2.89、13.51±5.12、188.24±374.04;a/(b +γ)分别为4.43±1.17、0.56±0.49、9.62±4.37、2.14±1.58;γ/(b+γ) 分别为0.04±0.03、0.92±0.06、0.28±0.18、0.95±0.04。由于组与组之间均值变异范围较大,将其进行对数转换后再进行方差分析。结果表明： a/b与a/(b+γ)在所有组与组之间均有显著性差异。γ/(b+γ)除了在脐带血组和重型b地贫组之间无显著性差异外,在其他组与组之间均有显著性差异。实验说明,人类b珠蛋白基因的表达水平从正常对照组到重型b地贫组急剧下降且以重型b地贫组为最低;相反γ珠蛋白基因表达却明显升高,以重型b地贫组为最高。与正常成人对照组相比,胎儿期b mRNA水平较低但γmRNA 水平较高。因此,正常个体不同时期和不同类型b 地贫之间a、b与γ珠蛋白基因表达不同而且互相影响。 Abstract：whole blood samples were collected from 100 normal healthy adults, from umbilical cord of 33 newborn infants, 111 individuals with b-thalassemia minor (bT/bA,aa/aa) and 39 with b-thalassemia major (bT/bT,aa/aa). Prior to quantitative analysis of globin gene expression, DNA was extracted from all blood samples and used for b-thalassemia genotype analysis. Different types of b globin gene mutations were analyzed using reverse dot blotting (RDB) method. Total RNA were extracted and subjected to real-time RT-PCR for quantitative measurement of a, b andγglobin mRNA using three sets of primers and fluorescent-labeled probes, designed according to the sequences of a, b andγhuman globin gene. Real-time RT-PCR was performed in ABI 7700 system. Following the real-time RT-PCR, the mean values of a, b andγglobin mRNA were calculated and the ratios of a/b, a/(b + γ) andγ/(b + γ) were determined to characterize the relative expression levels of different globin genes among normal adult, infant, b-thalassemia minor and b-thalassemia major patients. The resultant data were analyzed using SPSS 10.0 software to determine statistical significance of human globin gene expression among normal controls and b-thalassemia patients. Due to vast variations of the mean globin gene mRNA levels among different groups, log conversion of a/b + 1, a/(b + γ) + 1 andγ/(b + γ) +1 was used for statistical analyses and intergroup comparison. The a/b globin gene mRNA ratios were determined to be 4.62±1.20, 7.81±2.89, 13.51±5.12, and 188.24±374.04 for normal healthy adult (bA/bA,aa/aa), infant (bA/bA,aa/aa), b- thalassemia minor (bT/bA,aa/aa) and b-thalassemia major(bT/bT,aa/aa) respectively. The a/(b+γ) ratios were 4.43±1.17, 0.56±0.49, 9.62±4.37, and 2.14±1.58 for normal healthy adult (bA/bA,aa/aa), infant (bA/bA,aa/aa), b- thalassemia minor (bT/bA,aa/aa) and b- thalassemia major(bT/bT,aa/aa) respectively. Theγ/(b+γ) ratios were 0.04±0.03, 0.92±0.06, 0.28±0.18, and 0.95±0.04 for normal healthy adult (bA/bA,aa/aa), infant (bA/bA,aa/aa), b- thalassemia minor (bT/bA,aa/aa) and b- thalassemia major(bT/bT,aa/aa) respectively. Following statistical analyses, the a/b and a/(b+γ) globin gene mRNA ratios were significantly different among four different groups (normal adult, normal infant, b- thalassemia minor and b- thalassemia major). The γ/(b + γ) globin gene mRNA ratio was significantly different among all groups except for between infant and b- thalassemia major patients. Human b globin gene mRNA levels decrease progressively and dramatically from normal adults to b-thalassemia patients with b-thalassemia major having the lowest levels. On the other hand, the γglobin gene mRNA levels increase progressively from normal adult to b-thalassemia patients with b-thalassemia major having the highest levels. Infants have relatively lower levels of b but higher levels of γglobin gene mRNA as compared to those in normal adults. Thus, the relative expression levels of a, b or γglobin genes varied but inter-related among different ages of normal individuals and different b-thalassemia genotypes.     

昆虫杆状病毒系统表达口蹄疫病毒3ABC基因

以O型口蹄疫病毒为研究对象,经过RTPCP扩增得到非结构蛋白3ABC基因,克隆到转移载体pFastbacHT,将其转入含穿梭载体Bacmid的DH10Bac,与Bacmid发生位点特异性转座作用,得到3ABC的重组穿梭载体Bacmid3ABC,再将其转染昆虫细胞HiFive。PCR鉴定证实3ABC基因正确地插入到病毒基因组的多角体蛋白基因启动子下游,经过SDSPAGE和Westernblot检测,3ABC基因在昆虫细胞中表达了大小约为50kDa的蛋白条带,3ABC基因在BactoBac系统中的成功表达为建立以基因工程产品为抗原、鉴别诊断自然感染和免疫动物的方法提供了技术条件。     

健康妇女下生殖道解脲脲原体及其分群分型研究

目的了解健康妇女下生殖道Uu携带情况和定量值,揭示正常携带状态下Uu的分群分型情况。方法对2005年4月至8月在中山大学附属第二医院体检中心进行体检的健康妇女1018例,取宫颈分泌物进行Uu FQ-PCR检测,Uu阳性标本再用RDB法进行Uu分群分型。结果1018例中Uu阳性371例(阳性率36.4%),其中Uu FQ-PCR<1×106copy/ml且Uu呈单独阳性289例(77.9%)。371例Uu阳性标本,可以检测出血清型的共337例,未检出34例,总检出率为90.8%。parvum群278例(82.5%),urealyticum群30例(8.9%),两群混合阳性29例(8.6%);parvum群中,血清1型单型别阳性50例(18.0%),血清3型单型别阳性81例(29.1%),血清6型单型别阳性111例(39.9%),血清14型单型别阳性4例(1.4%),多型别阳性32例(11.5%)。结论Uu在健康妇女下生殖道中存在无症状的携带状态。在健康妇女中,Uu主要表现为Uu定量<1×106copy/ml而且Uu呈单独阳性。健康妇女中Uu以parvum群占优势,并且以parvum群中的1、3、6型的单型别为主,提示parvum群,尤其是其中的1、3、6单型别是正常人群携带的可能性较大。     

反相斑点杂交法对解脲脲原体分型的研究

目的研究以聚合酶链反应为基础的快速检测与鉴定解脲脲原体基因型的方法。方法选择2003年11月至2005年11月在中山大学附属第二医院门诊就诊的有外阴阴道炎症状和体征的患者601例,设为病例组,同期无自觉症状的正常体检人群306例,设为对照组,分别取宫颈分泌物待检测。将解脲脲原体不同基因型的特异探针固定在硝酸纤维素膜上,临床标本按常规方法提取解脲脲原体DNA,采用生物素标记的解脲脲原体特异通用引物PCR扩增DNA,然后分别与解脲脲原体不同基因型特异探针杂交、显色。结果病例组解脲脲原体阳性421例占70.0%,对照组解脲脲原体阳性126例占41.2%。病例组中单型别感染的U.parvum占65.4%,其中1型、3型、6型和14型分别占28.8%、43.3%、26.0%和1.9%,U.urealyticum占18.4%;对照组中单型别感染的U.parvum占79.3%,其中1型、3型、6型和14型分别占63.2%、21.1%、15.7%和0.0%,U.urealyticum占13.8%。18例阳性标本随机DNA测序鉴定,均为相应的解脲脲原体基因型。结论U.parvum群,尤其是其中的1、3、6型别是正常人群携带的可能性较大,U.urealyticum则有可能和1型起协同作用或独自导致疾病。用反相斑点杂交进行解脲脲原体基因分型,方法简单、实用,适用于临床。     

昆虫杆状病毒系统表达口蹄疫病毒3ABC基因

以O型口蹄疫病毒为研究对象,经过RT-PCP扩增得到非结构蛋白3ABC基因,克隆到转移载体pFastbacHT,将其转入含穿梭载体Bacmid的DH10Bac,与Bacmid发生位点特异性转座作用,得到3ABC的重组穿梭载体Bacmid-3ABC,再将其转染昆虫细胞Hi Five.PCR鉴定证实3ABC基因正确地插入到病毒基因组的多角体蛋白基因启动子下游,经过SDS-PAGE和Western blot检测,3ABC基因在昆虫细胞中表达了大小约为50kDa的蛋白条带,3ABC基因在Bac-to-Bac系统中的成功表达为建立以基因工程产品为抗原、鉴别诊断自然感染和免疫动物的方法提供了技术条件.     

线粒体蛋白质组学研究进展

总结近年来不同物种线粒体蛋白表达谱的构建及线粒体蛋白功能的研究。线粒体蛋白质组正处于迅速发展阶段,但是由于分离、鉴定等技术的局限,线粒体蛋白数据库仍然贫乏。     

广州地区女性下生殖道感染致病微生物分析

目的 对广州地区女性下生殖道感染致病微生物状况进行调查,用以指导临床正确诊断治疗。方法 对以外阴瘙痒及自带增多为主诉的妇女患者进行临床检查,先取阴道分泌物进行pH、胺试验及假丝酵母菌、滴虫和线索细胞检查,同时采用特制密封棉拭子宫颈管内取样,然后采用重量差减法,求出分泌物的重量,采用荧光定量PCR测定解脲脲原体、淋球菌、沙眼衣原体,可疑部位取材作HSV和HPV检测及梅毒血清学检查。结果 在533例入选患者中,解脲脲原体感染345例占64．7％,沙眼衣原体感染142例占26．6％,阴道假丝酵母菌病117例占22％,非特异性阴道炎81例占15％,细菌性阴道病17例占0．03％。尖锐湿疣12例占0．02％。淋病5例,梅毒4例,生殖器疱疹2例,滴虫阴道炎2例。结论 解脲脲原体、沙眼衣原体、阴道假丝酵母菌病是当前广州地区女性下生殖道感染的主要致病微生物,在选用抗生素时要兼顾解脲脲原体、沙眼衣原体。