肺炎链球菌LytR蛋白影响细菌生长和磷壁酸的合成

为了初步明确lytR基因的保守性以及探讨LytR蛋白在肺炎链球菌中的生物学功能。本研究利用PCR和测序方法分析lytR基因20种不同序列型肺炎链球菌临床分离株的保守性;利用Western blotting技术分析lytR在细菌不同生长阶段的表达情况;随后,利用红霉素片段替代lytR基因构建D39ΔlytR缺陷菌株,通过生长曲线分析、电镜下形态观察、以及磷壁酸含量测定揭示LytR蛋白在细菌生长、细菌形态以及磷壁酸合成中的作用。研究发现20种不同序列型肺炎链球菌临床菌株的lytR基因序列一致性99.3%;Western blotting结果显示lytR在细菌不同生长阶段稳定表达;D39ΔlytR缺陷株生长明显变缓,细菌表现为不成熟自溶;D39ΔlytR全菌磷壁酸含量显著减少,而培养基上清中的磷壁酸含量显著增多。本研究表明lytR基因非常保守,在肺炎链球菌不同生长阶段均有表达,并可能通过连接酶的作用影响细菌生长和参与肺炎链球菌磷壁酸的合成,有望成为一种新的抗生素和药物靶点。     

肺炎链球菌糖代谢蛋白CcpA对荚膜多糖的调控作用

摘要:【目的】研究肺炎链球菌糖代谢蛋白CcpA对肺炎链球菌荚膜多糖(CPS)的调控作用。【方法】利用大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)工程菌原核表达CcpA蛋白,使用Ni2+亲和层析的方法纯化蛋白。利用纯化后的CcpA蛋白免疫昆明小鼠并制备多克隆抗体;采用ELISA法测定抗CcpA抗体效价。随后,利用Westertn blot方法分析CcpA蛋白在肺炎链球菌中的保守性。另外,利用EMSA方法分析CcpA与cps基因座启动子区域片段的结合。最后,构建ccpA基因缺失株和ccpA基因回复株;利用ELISA法测定野生D39菌 株、ccpA基因缺失株和ccpA基因回复株的荚膜多糖含量。【结果】Western blot结果显示CcpA蛋白在多种血清型的肺炎链球菌均有表达,CcpA蛋白可与cps基因座启动子区域结合,且呈剂量依赖性;ccpA基因缺失时,细菌CPS含量升高,回复表达CcpA蛋白后,CPS含量显著降低。【结论】CcpA是肺炎链球菌中一种保守表达的蛋白,可通过调节cps基因座启动子负性调控肺炎链球菌荚膜多糖的表达。     

肺炎链球菌cps操纵子的启动子序列点突变可导致细菌荚膜缺失

摘要:【目的】明确肺炎链球菌荚膜多糖合成操纵子的启动子序列出现的点突变313713 T→C是否可导致细菌荚膜缺失。【方法】Western blot检测肺炎链球菌突变株SPY1 (NC_008533.1 313713 T→C)荚膜多糖含量;实时定量荧光PCR分析荚膜多糖合成基因cps2A、cps2B、cps2C以及cps2D的表达量;构建重组质粒pEVP3-cps promoterD39和pEVP3-cps promoterSPY1,分别转化D39和SPY1菌株,通过β-半乳糖苷酶活性检测来验证转入的启动子序列对细菌荚膜合成的影响,并通过电镜观察荚膜结构和荚膜肿胀试验进一步验证。【结果】肺炎链球菌SPY1 的荚膜多糖含量较野生型显著下降,其相关基因cps2A、cps2B、cps2C以及cps2D的表达量较野生型D39均显著降低;与D39-pEVP3-cps promoterD39对比,D39-pEVP3-cps promoterSPY1的β-半乳糖苷酶活性下降了76%,与SPY1-pEVP3-cps promoterD39相比,SPY1-pEVP3-cps promoterSPY1的β-半乳糖苷酶活性下降了约79%;电镜结果显示,重组SPY1-pEVP3-cps promoterD39荚膜可恢复至野生型水平,并且重组D39-pEVP3-cps promoterSPY1 (NC_008533.1 313713 T→C)荚膜肿胀试验呈阴性。【结论】荚膜多糖合成操纵子的启动子序列点突变313713 T→C可导致荚膜多糖合成基因表达显著下调,从而引起菌株SPY1的荚膜显著减少甚至缺失。     

粳稻穗角与稻米品质的相关性及稻米品质遗传分析

测定了粳稻直立穗品种丙8979与弯曲穗品种C堡杂交组合的P1、P2及其重组自交系349个株系的穗角和10个稻米品质性状, 分析了穗角与稻米品质性状之间的相关性, 并运用主基因+多基因混合遗传模型, 对稻米品质10个性状进行了遗传分析。结果表明,穗角与糙米率、整精米率、垩白粒率、垩白度、糊化温度、胶稠度和直链淀粉含量均无显著相关; 与精米率呈显著正相关(r=0.124*); 与粒长和长宽比均呈极显著正相关(相关系数分别为0.470**和0.241**)。糙米率、精米率和直链淀粉含量均受2对主基因+多基因控制, 2对主基因具有累加作用和加性×加性的上位性作用; 整精米率、粒长、长宽比和胶稠度受2对加性-上位性主基因+多基因控制;垩白粒率、垩白度和糊化温度均受3对加性-上位性主基因+多基因控制。糙米率、精米率、整精米率、垩白粒率、垩白度和糊化温度6个品质性状以主基因遗传为主,粒长、长宽比、胶稠度和直链淀粉含量4个性状以多基因遗传为主。     

云南会泽铅锌矿废弃矿渣堆常见植物内生真菌多样性

从云南会泽铅锌矿废弃矿渣堆上的常见植物硬毛南芥(Arabis hirsuta)、毛萼香茶菜(Rabbosia eriocalyx)和倒挂刺(Rosa longicuspis)等6种植物的690个组织块中共分离得到内生真菌495株,内生真菌的分离频率在0.42—0.93之间,平均为0.72,所有植物茎内生真菌的分离频率都明显高于叶(P<0.05)。经形态学鉴定,内生真菌分属于茎点霉属(Phoma)、交链孢属(Alternaria)和派伦霉属(Peyronellaea)等20个分类单元,其中茎点霉属和派伦霉属为该废弃矿渣堆上常见植物的优势内生真菌属。6种植物内生真菌的多样性指数在1.05—2.29之间,与其它非重金属污染环境植物内生真菌的多样性指数相似,说明在重金属污染地区仍然存在多种重金属耐受的内生真菌种类。6种植物内生真菌的相似性系数(0.455—0.833)表明,会泽铅锌矿区植物内生真菌的宿主专一性较小。     

不同水分梯度下楸树苗期生长及光合特征比较

以1a生楸树根插苗为试验材料, 设置95%—100%FC、85%—90%FC、70%—75%FC、50%—55%FC等不同梯度的土壤含水量, 对生长旺季的光合特征及生长量进行测量, 研究苗期楸树对不同土壤水分含量的生长及光合特征响应。结果显示: 高土壤含水量(≧85%FC)和低土壤含水量(≦75%)地径和苗高生长量差异显著(P<0.05), 随着土壤含水量逐渐下降, 地径和苗高生长量、根重、茎重及根干比均呈下降趋势。光合特征比较发现, 上午净光合速率显著高于下午, 净光合速率的日变化主要直接受制于气孔因素; 85%—90%FC处理叶片的净光合日总量最大, 50%—55%FC处理叶片的净光合日总量最小。在所有光强梯度下, 高土壤水分含量处理(≧85%FC)的叶片净光合速率均明显较高, 尤其是85%—90%FC处理, 光利用能力和光合潜力都具有较大优势。从生长和光合特征综合分析结果可以看出, 四种处理中85%—90%FC处理最有优势和潜力, 是楸树苗期生长最为适宜的土壤含水量。     

RhoA和血清反应因子(SRF)介导E1A激活基因阻遏子诱导人血管平滑肌细胞分化

为探讨E1A激活基因阻遏子(CREG)对人血管平滑肌细胞(VSMCs)分化的调控机制,应用重组逆转录病毒表达载体pLNCX2( )/CREG及pLXSN(-)/CREG制备稳定感染HITASY细胞模型,观察CREG蛋白过表达及表达抑制对人VSMCs分化的影响并探讨其调控机制.结果显示:pLNCX2( )/CREG稳定感染细胞呈分化表型,细胞细长变成组织样聚集生长趋势,细胞中CREG蛋白和平滑肌分化标志蛋白平滑肌α-肌动蛋白(SMα-actin)表达显著增加,同时SMα-actin相关调控因子——血清反应因子(SRF)入核转位,RhoA总蛋白表达上调,以Rho激酶特异性抑制剂Y-27632作用后,CREG诱导的SMα-actin表达下调的同时SRF出核转位;pLXSN(-)/CREG稳定感染的细胞体积变大,细胞极性消失,呈无序生长,细胞中CREG和SMα-actin蛋白表达显著降低,同时伴有SRF出核转位及RhoA总蛋白表达下调.免疫共沉淀分析发现,CREG蛋白能被分泌到VSMCs培养基中表达,并可与细胞膜受体6-磷酸甘露糖/胰岛素样生长因子Ⅱ型受体(M6P/IGF2R)发生直接相互作用.用蛋白磷酸酶PP2A特异性抑制剂okadaicacid减少M6P/IGF2R在细胞膜表面分布,可明显抑制CREG过表达引起的RhoA、SRF和SMα-actin表达.上述结果提示,在体外培养的人VSMCs中,CREG可能作为一种分泌型蛋白质通过与细胞膜受体M6P/IGF2R相互作用,依次激活SMα-actin蛋白相关调控因子RhoA和SRF引起SMα-actin表达增加,促进VSMCs向分化表型转换.     

转录因子E2F1抑制CREG表达调控体外培养的人血管平滑肌细胞分化

为探讨转录因子E2F1在血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)表型转化中的作用及其对E1A激活基因阻遏子(cellular repressor of E1A-stimulated genes,CREG)表达调控的分子机制,应用生物信息学方法,定位人CREG(hCREG)基因启动子并确定转录因子E2F1在hCREG启动子区的结合位点,PCR方法克隆并构建hCREG基因启动子绿色荧光报告基因载体,以hCREG启动子区E2F1结合位点为模板,化学合成E2F1寡聚脱氧核苷酸(ODN)和错配E2F1ODN,利用转录因子"诱骗(Decoy)"策略,用E2F1ODN转染体外培养的VSMCs以阻断E2F1与hCREG基因启动子区的结合,蛋白质印迹(Western blot)分析检测阻断前后细胞内hCREG蛋白、报告基因绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)和平滑肌细胞分化标志蛋白SMα-actin表达变化.结果显示:分化表型HITASY细胞中E2F1表达下调伴出核转位,而增殖表型的HITASY细胞中E2F1蛋白表达明显增加且定位于核内.进一步应用FuGene6瞬时转染E2F1ODN和错配E2F1ODN于体外培养HITASY细胞中,蛋白质印迹分析发现,转染E2F1ODN后,HITASY细胞中hCREG、SMα-actin和GFP表达均较未阻断组及错配组细胞明显增加.上述研究结果证实,E2F1是hCREG基因转录的重要调控因子,能够直接结合于hCREG启动子区阻遏hCREG表达,参与hCREG蛋白对VSMCs表型转化的调控作用.     

鄂西南木林子常绿落叶阔叶混交林恢复过程中优势树种生态位动态

运用Shannow-wiener生态位宽度指数和Pianka生态位重叠指数,分析了鄂西南木林子常绿落叶阔叶混交林恢复过程中优势树种生态位动态。结果表明:大穗鹅耳枥(Carpinus fargesii)、四照花(Cornus kousa var.Chinensis)、青冈(Cycloblanopsis glauca)生态位总宽度较大,且在5个不同恢复时期均有分布。恢复期14a、35a、60a、85a和110a生态位宽度最大的树种分别为白马桑(Weigela japonica var.sinica)、大穗鹅耳枥、四照花、光皮桦(Betula luminifera)和尾叶冬青(Ilex wilsonii)。随着群落的恢复,优势落叶树种生态位宽度表现出下降趋势,优势常绿树种则呈上升趋势。当恢复到顶极群落阶段,乔木层常绿和落叶树种生态位接近,灌木层常绿灌木占据较大生态位。随着群落的恢复,优势落叶树种与其它树种的生态位重叠值呈波动性下降趋势,优势常绿树种表现为波动性上升趋势,群落全部树种间生态位重叠程度呈小幅度波动性下降趋势。相同或相似生活型的演替早期种间的高生态位重叠,意味着种间对资源利用的相似性和竞争关系,演替后期种与其它树种间的生态位重叠的增加,意味着不同生活型树种在水平空间重叠而在垂直空间分化,这是不同树种对有限环境资源充分利用的一种机制。     

蚕沙发酵肥在制作过程中的微生物结构变化

目的比较蚕沙发酵肥在发酵前后的微生物结构变化,阐明蚕沙发酵肥的微生物多样性。方法蚕沙发酵肥由基底土和蚕沙按一定比例混合后发酵30d而来,因此实验共分为4个处理组,分别为基底土组、蚕沙组、蚕沙发酵肥30d组和蚕沙发酵肥90d组。分别采集基底土、蚕沙以及发酵30d后的蚕沙发酵肥进行MiSeq高通量测序,比较蚕沙发酵肥与发酵前的基底土、蚕沙之间的细菌多样性变化,并采集发酵90d的蚕沙发酵肥进行测序,比较不同发酵时间对发酵肥细菌多样性的影响。结果蚕沙发酵肥30d组的细菌多样性指数最高,蚕沙最低,说明蚕沙在与基底土混合发酵后细菌多样性水平升高。β多样性结果显示蚕沙发酵肥的稳定性好,且发酵肥与蚕沙的近缘关系较与土壤的更近。比较优势菌属发现,蚕沙发酵肥30d组有10种优势菌属,分别为Sphingobacterium、Parapedobacter、Ochrobactrum、Flavobacterium、Bordetella、Brucella、Rhizobium、Olivibacter、Devosia和Paracoccus;发酵肥90d组中的优势菌属有70%与30d组相同;蚕沙组中仅有5种优势菌属,分别为Parapedobacter、Bacillus、Pseudomonas、Flavobacterium和Sphingobacterium,其中Parapedobacter、Flavobacterium和Sphingobacterium也为发酵肥30d组的优势菌属;基底土的优势菌属大部分为酸杆菌门,分别为Gp1、Gp2、Gp3、Bradyrhizobium、Rhizomicrobium和Rhodoplanes,它们在经发酵后含量大大下降。蚕沙发酵肥中的大部分优势菌属均为具有生防作用的生防菌,其中部分优势菌属也存在于施用了发酵肥的连作白菊根际土中。结论蚕沙与基底土混和发酵制成蚕沙发酵肥后细菌多样性发生显著变化,生防菌种类显著增加,同时蚕沙发酵肥中的这些生防菌来源于蚕沙并非基底土。蚕沙发酵肥缓解连作障碍的机制之一可能是由于蚕沙发酵肥中存在的大量生防菌。