HBV前S1蛋白与HepG2细胞膜蛋白结合位点鉴定

为鉴定HepG2细胞膜蛋白识别HBV包膜蛋白preS1区的位点.通过删除突变的方法构建preS1的不同区域片段与GST融合的重组表达质粒,将表达质粒转入E.coli BL21菌株中原核表达,以生物素标记HepG2细胞膜蛋白,pull down试验分析HepG2细胞膜蛋白识别preS1的位点.结果表明,21～33位氨基酸是HepG2细胞膜蛋白识别preS1的主要位点.通过对HepG2细胞膜蛋白与preS1结合的位点的分析,为进一步研究preS1在HBV早期感染中的作用和HBV包膜蛋白受体打下基础.     

丙型肝炎病毒核心蛋白稳定表达肝癌细胞株的构建及生物学研究

旨在构建稳定表达HCV核心蛋白的稳定细胞系Huh7-Core并进行初步的生物学功能研究.利用PCR技术扩增HCV核心蛋白基因,通过酶切连接反应将目的基因克隆至载体pSEB-3Flag中,将重组质粒pSEB-3F-Core和辅助质粒pAmpho共转染Huh7细胞,经过Blasticidine抗性筛选,建立稳定表达HCV核心蛋白的肝癌细胞系Huh7-Core.采用RT-PCR、Western blot鉴定Huh7-Core细胞株中核心蛋白的稳定表达并采用MTS、结晶紫试验观察Huh7-Core稳定细胞株的增殖情况.结果显示,成功构建了表达HCV核心蛋白的稳定细胞株Huh7-Core.结晶紫、MTS试验证实Huh7-Core细胞较Huh7-3Flag细胞增殖速度增快,表达HCV核心蛋白的Huh7-Core稳定细胞株构建成功,Core稳定表达后可促进Huh7细胞生长速度.     

丙型肝炎病毒E1蛋白活化MAPK／ERK信号通路促进肝癌细胞增殖

目的研究丙型肝炎病毒（hepatitisCvirus,HCV）编码蛋白E1的生物学功能。方法分别构建编码HCV重要蛋白E1、E2、NS3、NS5a、NS5b的腺病毒载体Ad—E1、Ad—E2、Ad—NS3、Ad—NS5a、Ad—NS5b;将重组并包装的腺病毒分别感染SMMC-7721细胞,测定感染滴度,通过RT—PCR方法在转录水平鉴定HCVE1、E2、NS3、NS5a、NSSb的表达,用Western印迹在蛋白水平鉴定E1蛋白的表达。腺病毒感染SMMC-7721细胞后,通过细胞增殖实验筛选生物学功能最明显的蛋白。将筛选到的Ad—E1感染SMMC-7721细胞,用MTS、结晶紫、细胞周期实验观察体外过表达E1蛋白对感染细胞增殖的影响;Western印迹检测p-ERK、ERK的表达;RT—PCR检测c—Myc、cyclinD1、c—Jun、c．Fos基因的表达。结果成功扩增了能够编码HCV重要蛋白E1、E2、NS3、NS5a、NS5b的高滴度腺病毒Ad—E1、Ad—E2、Ad—NS3、Ad—NS5a、Ad—NS5b,并且通过RT—PCR方法在转录水平鉴定了目的基因的表达,Western印迹方法在蛋白水平鉴定了E1蚩白的表达。通过细胞计数、MTS、结晶紫实验证实Ad—E1感染组细胞较对照组增殖速度加快,细胞周期显示Ad-E1感染组细胞34．38％处于S期,明显高于Ad—GFP（27．32％）（P〈0．05）对照组;Ad-E1感染绢p-ERK蛋白表达量增高,同时与细胞增殖相关的MAPK／ERK下游基因转录水平上凋。结论体外过表达HCVE1蛋白可以明显促进SMMC-7721细胞的增殖,其促增殖作用可能与MAPK／ERK信号通路的活化相关。     

RNA干扰技术对肝癌细胞内源survivin基因表达的影响

应用RNA干扰技术（RNAi）研究针对凋亡抑制因子survivin的siRNA抑制肝癌细胞株内源survivin基因的表达.转染重组质粒pshRNA-survivin至肝癌细胞株SMMC-7721,通过免疫荧光、蛋白质印迹和半定量RT-PCR检测survivin蛋白表达及mRNA转录水平的变化.结果表明：构建的三种重组质粒pshRNA-survivin1/2/3均能明显抑制survivin基因的表达;应用免疫荧光检测survivin基因的表达,转染重组质粒pshRNA-survivin的实验组survivin荧光强度明显低于转染载体pTZU6＋1和pshRNA-GFP对照组;蛋白质印迹结果表明,重组质粒pshRNA-survivin明显抑制survivin蛋白的表达,抑制率为62%～78％,通过半定量RT-PCR检测到survivin基因mRNA转录明显减少,抑制率为57%～64％.由上述结果可以得出结论：重组质粒pshRNA-survivin可明显抑制SMMC-7721细胞内源survivin的表达和mRNA的转录,为survivin介导的肿瘤基因沉寂疗法提供实验基础.     

RNA干扰技术抑制内源性绿色荧光蛋白的表达

目的建立稳定表达绿色荧光蛋白(GFP)的细胞株;构建短发夹RNA(shRNA)表达质粒并观察其对内源性GFP的抑制作用。方法转染pEGFP-N1至HepG2细胞,利用G418筛选获得稳定表达GFP的细胞株(HepG2.GFP);设计合成针对GFP基因的siRNA对应的DNA片段,插入转录载体pTZU6 1,构建shRNA表达载体pSHGFP,转染HepG2.GFP,荧光显微镜观察细胞荧光强度,以western blot检测GFP蛋白水平,以RT-PCR检测mRNA水平。结果利用PCR方法从HepG2.GFP细胞基因组DNA中检测到GFP基因;pSHGFP能够显著抑制该细胞中GFP的表达。结论GFP基因成功整合至HepG2细胞基因组中,pSHGFP能够显著抑制内源性GFP的表达,该系统能够用于RNA干扰机制等研究中。     

丙型肝炎病毒重要编码蛋白重组腺病毒载体的构建

旨在构建含HCV core、E1、E2、F、NS3、NS5a和NS5b基因的重组腺病毒载体。运用PCR技术扩增目的基因片段,通过酶切连接方法将上述7种基因片段克隆至穿梭质粒pAdTrack-TO4中,然后将重组质粒用PmeⅠ线性化后与骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183细菌中同源重组。用PacⅠ酶把重组腺病毒载体线性化后转染HEK293细胞后产生重组腺病毒颗粒。利用穿梭质粒中带有绿色荧光蛋白GFP对其感染效率进行监测。结果显示,酶切鉴定和测序结果均证实含core、E1、E2、F、NS3、NS5a和NS5b基因的重组腺病毒构建成功,在感染的Huh7细胞中观察到绿色荧光蛋白GFP。成功制备了高滴度的腺病毒Ad-core、Ad-E1、Ad-E2、Ad-F、Ad-NS3、Ad-NS5a和Ad-NS5b,为后续研究奠定了基础。     

shRNA表达载体构建方法的优化

目的探讨shRNA表达载体的构建方法 ,以加速RNA干扰研究的进程。方法对shRNA表达载体的构建过程进行分析和监测 ,并加以优化。结果发现shRNA表达载体构建的退火过程容易产生障碍 ,经优化退火缓冲液的NaCl含量后 ,能明显提高退火效率及shRNA表达载体构建的成功率。结论shRNA表达载体构建的退火过程需加以关注 ,退火缓冲液中NaCl含量应提高至 2 0 0mmol/L以上为宜     

抗乙肝病毒shRNA表达载体转染条件的优化

目的优化抗乙肝病毒(HBV)短发夹样RN(A short hairpin RNA,shRNA)表达载体转染条件,从而克服过量转染所致细胞大批死亡的弊端,以便更客观地反映RNA干扰抗乙肝病毒的效率、方法,通过脂质体介导,将HBV真核表达载体pHBV1.3与我们以前研究确定为能有效抗乙肝病毒的shRNA表达载体pTZU6-C共同转染肝癌细胞HepG2,将共转染的两种质粒及所需的脂质体设立成不同浓度和比例,以pHBV1.3与不表达shRNA的空载体pTZU6的共转染作为未干扰阴性对照,转染36h后收集细胞,通过Southern杂交来观察乙肝病毒DNA明显复制和显著受抑时,所需pHBV1.3与pTZU6-C的最适剂量和比例,以及相应脂质体的用量;同时,通过Western杂交来观察HBV蛋白表达的变化。结果通过southern杂交,发现当将pHBV1.(3μg):pTZU6-C(μg)固定为6:1,脂质体(μl):质粒(μg)为1:1时,对于100ml培养瓶中90%以上融合的细胞,用3.5μl的脂质体共转染0.5μg pHBV1.3和3μg pTZU6-C,即可检测出HBV DNA的表达,此时,存活细胞总数不受任何影响;随着pHBV1.3量的增多,HBV DNA的表达亦增多;当pHBV1.3增至4μg时,虽然表达量增多,但存活的细胞总数却开始明显减少,存活细胞约为70%～80%;当用8μg时,存活的细胞不足40%～50%,检测水平反而下降。当pHBV1.(3μg):pTZU6-C(μg)为1:1时,即可观察到乙肝病毒DNA表达的明显抑制作用,其抑制率为71%;当两者的比例为1:2时,其抑制率为70%;比例为1:6时,抑制率为84%。Western杂交的结果亦证实,共转染0.5μgpHBV1.3和3μg pTZU6-C,即可检测出HBV蛋白的表达;但转染36h后,尚未能观察到HBV表面抗原(HBsAg)表达明显受抑的情况。结论抗乙肝病毒shRNA表达载体的转染条件需要优化,对于100ml培养瓶中90%以上融合的细胞,用6μl的脂质体共转染2μg pHBV1.3和4μg pTZU6-C,即可观察到明显的HBV表达和显著的RNA干扰抑制效果,本研究结果为下一步针对乙肝病毒不同靶区shRNA表达载体的转染奠定了坚实的基础。     

向下转膜法在乙肝病毒Southern杂交中的应用

目的评价向下转膜法在乙肝病毒(HBV)Southern杂交中的应用效果。方法用带有1.3倍HBV基因的真核表达载体转染HepG2细胞,使其产生瞬时HBV表达,72小时收集细胞并提取细胞总DNA,琼脂糖凝胶电泳后,以向上和向下两种方式转移在尼龙膜上;用化学发光标记和检测试剂盒将乙肝病毒基因片段标记成探针,再与向上和向下转膜后的尼龙膜进行杂交,判断产生明显HBV杂交条带所需的细胞总DNA量,从而验证向下转膜法在乙肝病毒Southern杂交中的应用效果。结果发现向下转膜后,检测HBV表达所需的细胞总DNA量极少,灵敏度高,0.5μg细胞总DNA电泳后转膜,即可检测出HBVDNA的表达,凝胶中仅有8%的DNA残留;而向上转膜所需的总DNA量大,灵敏度低,25μg的细胞总DNA电泳后转膜,仅能检测出弱的条带。结论向下转膜法是一种较好的转膜方式,适于对乙肝病毒的Southern杂交,值得推广应用。     

HepG2细胞膜上乙型肝炎病毒前S1蛋白（preS1）结合蛋白的研究

采用pull down技术研究preS1在HepG2细胞膜上的结合蛋白。以原核表达的GST-preS1融合蛋白为探针蛋白,与生物素标记的HepG2细胞裂解液进行pull down试验分离与preS1结合的膜蛋白。Western blot结果显示HepG2细胞膜上有一大小约110kDa蛋白（p110）与preS1结合。通过对比实验证明该蛋白具有较好的组织特异性和种属特异性。研究结果显示该蛋白是HepG2细胞膜上与preS1结合的蛋白,可能与HBV的早期感染过程有关。