CDADC1在人视网膜色素上皮细胞中功能研究

目的：研究细胞增殖相关基因CDADC1在人视网膜色素上皮细胞ARPE19中的表达及对ARPE19细胞增殖的影响。方法：采用基因重组技术构建荧光表达载体pEGFP－C1－CDADC1和真核表达载体pcDNA3．1-myc-CDADC1,用脂质体转染法转染ARPE19细胞,观察GFP—CDADC1融合蛋白在ARPE19细胞的表达定位,流式细胞仪测定CDADC1转染后对ARPE19细胞生长周期、凋亡的影响。结果：FP—CDADC1融合蛋白亚细胞定位显示,CDADC1低表达于ARPE19细胞胞浆,高表达于细胞核;pcD—NA3．1-myc-CDADC1瞬时转染ARPE19细胞显示24小时细胞无明显改变,48小时后重组质粒转染组S期细胞占细胞总数的19．37％,pcDNA3．1-myc空载质粒转染组S期细胞占10．87％,而空白对照组S期细胞占3．33％,重组质粒转染组与两对照组之间的差异有统计学意义（P〈0．01）。结论：CDADC1在增生性玻璃体视网膜病变（PVR）发生和发展过程中可促进DNA的合成,引起细胞增生。     

重叠PCR 法构建XLRS1 三种不同类型突变体

目的:构建X连锁视网膜劈裂(XLRS)三种不同类型突变体(点突变、缺失突变、插入突变),以便进一步构建不同类型的突变细胞模型。方法:根据NCBI gene数据库中XLRS1基因的CDS设计三对不同类型的引物,使用重叠PCR法获得突变片段,然后克隆入载体pLJM1-EGFP。结果:经测序验证,成功构建了三种不同类型突变体。结论:使用重叠PCR法构建三种不同类型突变体,为进一步研究XLRS1不同类型突变的致病机制奠定了基础。     

人、鼠原肠形成蛋白基因的克隆和初步分析

目的：分析原肠形成蛋白（TSG）在几个发育阶段的人和小鼠睾丸中的差异表达。方法：应用cDNA微阵列技术对成人和胚胎睾丸进行基因表达图谱分析,获得在成人高表达、胚胎低表达的人TSG的全长基因;利用RT-PCR,从4周龄小鼠睾丸中克隆出小鼠TSG基因,用地高辛标记的探针进行原位杂交,检测小鼠TSG在睾丸中的表达。结果：人TSG在成人睾丸中高表达,在胚胎中低表达;小鼠TSG仅在小鼠睾丸生殖细胞中表达,在间质细胞中不表达。结论：小鼠睾丸TSG与骨形态发生蛋白（BMP）可能同步表达,提示在小鼠精子发生中也可能存在一条由TSG信号激活BMP的传导途径。     

雷珠单抗联合复方血栓通与单独雷珠单抗治疗渗出老年性黄斑变性的前瞻性随机对照试验研究

目的:探讨复方血栓通(cFXST)对玻璃体腔注射雷珠单抗(IVR)治疗湿性老年性黄斑变性(wet-AMD)的辅助治疗作用。方法:纳入湿性老年性黄斑变性患者38例,以1:1的比例随机纳入Lucentis组(单独玻璃体腔注射雷珠单抗,19例)和cFXST组(玻璃体腔注射雷珠单抗联合复方血栓通,19例)。Lucentis组患者每月行玻璃体腔注射雷珠单抗(IVR),共计3次;cFXST组患者除IVR外,每日口服cFXST。分别在基线、玻璃体腔注射Lucentis后1个月、3个月记录最佳矫正视力(BCVA)和光学相干断层扫描(OCT)影像上视网膜新生血干至色素上皮下厚度(CNV-PED)。结果:cFXST组CNV-PED厚度在1月和3月分别降低31.7%和36.1%,高于Lucentis组的19.7%(P=0.021)、24.2%(P=0.018)。3个月后,cFXST组BCVA变化(P=0.045)及视力提高显著的患者比例(16/16 vs 8/17,P=0.001)明显高于Lucentis组。结论:每日口服cFXST治疗可提高抗VEGF治疗老年wet-AMD的短期疗效。     

不同方向撕除内界膜方式对特发性黄斑裂孔术后视网膜位移的影响

目的:比较玻璃体切割切术中不同方向撕除内界膜对特发性黄斑裂孔愈合后视网膜位移、视功能的影响。方法:纳入特发性黄斑裂孔患者25例(25眼),按照术中内界膜(ILM)撕除方向,以1:1随机分为NS-TI组(13眼)和TI-NS组(12眼)。NS-TI组患者接受内界膜撕除方向为鼻上起瓣,向颞下方向撕除ILM;TI-NS组患者接受内界膜撕除方向为颞下起瓣,向鼻上方向撕除ILM。术前、术后1月、术后3月采集患者自发荧光照相,通过影像学上血管标记点或交叉点的位置计算黄斑视盘距离(FMD)、颞侧血管至视盘距离(T-OD)、鼻侧血管至视盘距离(N-OD)、黄斑区垂直血管距离(VIAD)、黄斑区水平血管距离(HIAD)、黄斑区面积(PMA)。对比两种撕膜方式后术后1月、3月视网膜位移(包括FMD、T-OD、N-OD、VIAD、HIAD、PMA)、裂孔闭合率,术后最佳矫正视力,分析两种撕膜方式的异同。结果:术后1月及3月,两组患者的视网膜皆向视盘方向偏移,表现为FMD、T-OD、N-OD、VIAD、HIAD、PMA五项指标均较术前增大(p 0.05)。术后1月及3月,NS-TI组和TI-NS组FMD、T-OD、N-OD、VIAD、HIAD、PMA、黄斑裂孔愈合率(皆100%)和最佳矫正视力比较差异均无统计学意义(P0.05)。结论:不同方向撕除内界膜不是特发性黄斑裂孔术后视网膜位移的影响因素。     

碘酸钠诱导小鼠视网膜色素上皮变性模型的研究

目的:探讨股静脉注射不同剂量的碘酸钠后观察C57BL/6J小鼠视网膜色素上皮形态学及视网膜功能的变化。方法:选取30只6-8周龄C57BL/6J的雄性小鼠,随机分为正常对照组6只,实验1组(静脉注射碘酸钠10 mg/kg)6只,实验2组(静脉注射碘酸钠20 mg/kg)6只,实验3组(静脉注射碘酸钠35 mg/kg)6只,实验4组(静脉注射碘酸钠50 mg/kg);正常对照组注射同等剂量的生理盐水。实验组分别经股静脉注射碘酸钠10、20、35、50 mg/kg,于注射后1周行电生理检测,1周、2周行OCT检测。所有小鼠2周后摘除眼球制作冰冻切片以及RPE细胞平铺片进行HE染色、免疫荧光染色。结果:正常对照组小鼠视网膜各层排列整齐,各层之间分界清晰,外核层形态正常,RPE层细胞排列紧密。注射后1周,通过ERG可发现碘酸钠10 mg/kg组小鼠视锥细胞功能已出现损伤,但OCT显示视网膜形态正常;而20 mg/kg以及35 mg/kg小鼠除了视锥细胞功能出现损伤,视杆细胞的功能均降至对照组1/2;且视网膜外核层均出现异常高亮区,外层视网膜丧失分界清晰的结构。注射后2周,10 mg/kg组小鼠通过RPE细胞平铺片即可发现RPE细胞已出现轻微损伤。而20 mg/kg、35 mg/kg组小鼠通过OCT可发现外核层与对照组相比均明显变薄,视网膜出现退行性改变;且通过HE染色和RPE细胞平铺片以及冰冻切片,我们可以发现20 mg/kg、35 mg/kg小鼠外核层出现波浪状改变,单层RPE细胞的连续性被破坏,呈现剂量依赖性。结论:碘酸钠20 mg/kg组经静脉注射后,可以很好的模拟年龄相关性黄斑变性的发病过程,视网膜出现明显的形态和功能变化,为视网膜色素变性提供一个较好的小鼠动物模型。     

黄斑部视网膜前膜患者手术前后黄斑区结构变化及与视功能预后的关系

目的:探讨黄斑部视网膜前膜患者手术前后黄斑区域结构变化情况,及其与患者术后视功能的关系。方法:对2014年2月-2016年8月间在我院进行手术治疗的黄斑部视网膜前膜患者60例(60眼)的临床资料进行回顾性分析。所有患者均进行光学相干断层扫描(OCT)检查,观察黄斑中心凹及各方位视网膜厚度变化,同时记录患者手术前后最佳矫正视力(BCVA),分析其相关性。结果:术后53例(53眼)患者视力提高,占88.33%,7例(7眼)患者视力不变,占11.67%。术前患者BCVA为(0.18±0.07),术后3个月BCVA为(0.38±0.12),术后3个月BCVA较术前显著提高(P0.05)。患者术后黄斑中心凹厚度、内环颞侧厚度、内环鼻侧厚度、内环上方厚度、内环下方厚度、外环颞侧厚度、外环鼻侧厚度、外环上方厚度、外环下方厚度较术前均显著降低,差异具有统计学意义(P0.05)。经Pearson相关分析显示,患者术前黄斑中心凹厚度、内环颞侧厚度、外环颞侧厚度、术前后黄斑中心凹厚度差值、术前后内环颞侧厚度差值、术前后外环颞侧厚度差值与术后BCVA呈负相关(P0.05)。结论:玻璃体切除术可以显著降低黄斑部视网膜前膜患者黄斑区视网膜厚度,提高患者视功能,术前黄斑区域形态对患者术后视力恢复有一定影响。     

姜黄素抑制小鼠脉络膜新生血管的实验研究

目的：观察姜黄素对激光诱导的小鼠脉络膜新生血管（choroidalneovascularization,CNV）形成的影响。方法：60只雄性C57BL／6小鼠,随机分为对照组、10mg／kg姜黄素治疗组、30mg／kg姜黄素治疗组,每组20只。采用激光诱导产生小鼠CNV模型。由光凝前3天开始,至光凝后14天,两个治疗组每天分别给予腹腔注射相应剂量的姜黄素,对照组腹腔注射二甲亚砜溶液（溶剂）。光凝后第3天通过免疫组化和ELISA检测血管内皮生长因子（vesselendothelialgrowthfactor,VEGF）的表达;第14天通过组织学检查以及荧光素标记的葡聚糖的血管灌注检测CNV的面积,荧光血管造影评价CNV的渗漏程度。结果：光凝后第14天,组织学检查显示姜黄素能够有效缩小激光诱导的CNV;荧光素标记的葡聚糖血管灌注后测量色素上皮-脉络膜铺片上CNV的面积,和对照相比,姜黄素能显著减小激光诱导的CNV的面积（P〈0．05）;荧光血管造影显示姜黄素能有效抑制CNV的渗漏（P〈O．05）。和10mg／kg姜黄素治疗组相比,30mg／kg姜黄素治疗组小鼠CNV面积缩小和渗漏程度减弱（P〈0．05）。光凝后第3天,VEGF免疫组化和ELISA结果显示姜黄素显著抑制色素上皮一脉络膜复合体中VEGF（P〈0．01）的表达,高刺量组有更强的抑制作用（P〈0．01）。结论：姜黄素可以有效地抑制小鼠CNV的形成,下调VEGF的表达可能是姜黄素抑制CNV的作用机制之一。因此我们推测姜黄素对并发CNV的AMD患者可能具有治疗作用。     

胎儿视网膜色素上皮细胞的原代培养和体外增殖能力的测定

目的：建立胎儿视网膜色素上皮细胞（fRPE）的原代培养方法。方法分离流产胎儿RPE,并进行体外原代培养、传代,免疫荧光检测培养RPE细胞分子标志物。以β细胞增殖诱导剂（二芳基脲衍生物WS3）刺激RPE细胞增殖,并测量其生长曲线。3组细胞比较采用单因素F检验。结果源自不同胎儿的fRPE细胞在原代及体外增殖中并未表现出明显不同。在体外扩增的4代fRPE中,100﹪的细胞表现出了良好的细胞形态。免疫荧光染色证实了体外扩增的fRPE细胞可很好的表达RPE细胞标记物。WS3未见有刺激RPE细胞体外增殖的作用。培养后不同时间三组细胞差异均有统计学意义（F=119.437~234.368,P均=0.000）。结论 fRPE细胞可在非复杂的培养环境中实现体外大量增殖,这些体外增殖的fRPE细胞可以为RPE移植细胞治疗视网膜黄斑病变提供丰富的细胞来源。     

CDADC1在人视网膜色素上皮细胞中功能研究

目的:研究细胞增殖相关基因CDADC1在人视网膜色素上皮细胞ARPE19中的表达及对ARPE19细胞增殖的影响。方法:采用基因重组技术构建荧光表达载体pEGFP-C1-CDADC1和真核表达载体pcDNA3.1-myc-CDADC1,用脂质体转染法转染ARPE19细胞,观察GFP-CDADC1融合蛋白在ARPE19细胞的表达定位,流式细胞仪测定CDADC1转染后对ARPE19细胞生长周期、凋亡的影响。结果:FP-CDADC1融合蛋白亚细胞定位显示,CDADC1低表达于ARPE19细胞胞浆,高表达于细胞核;pcD-NA3.1-myc-CDADC1瞬时转染ARPE19细胞显示24小时细胞无明显改变,48小时后重组质粒转染组S期细胞占细胞总数的19.37%,pcDNA3.1-myc空载质粒转染组S期细胞占10.87%,而空白对照组S期细胞占3.33%,重组质粒转染组与两对照组之间的差异有统计学意义(P<0.01)。结论:CDADC1在增生性玻璃体视网膜病变(PVR)发生和发展过程中可促进DNA的合成,引起细胞增生。