鲤脑组织低温差异表达候选基因的筛选

采用双标准曲线相对实时荧光定量PCR法,分别以23℃常温对照组和6℃低温待测组的黑龙江鲤脑组织cDNA为模板,以18S rRNA为内参基因,检测26个候选基因的相对表达量。实验数据经显著性分析发现,有5个候选基因在低温条件下表达量显著上升(P<0.01),与对照组相比它们的表达量分别上升了2.11倍、13.9倍、2.52倍、7.38倍和1.83倍,基因功能比对结果表明其编码蛋白产物分别是脂肪酸链延伸蛋白、酰基辅酶A脱氢酶、转录起始因子IIB、肌醇-1-磷酸合成酶、血脑屏障HT7抗原;有7个候选基因在低温下表达量分别下降了21.8%、25.9%、16.6%、23.7%、15.8%、16.3%、42.5%,但对照组和待测组差异不显著(P>0.05),基因功能比对发现它们主要参与抑制糖酵解,促进细胞凋亡和干扰神经系统的重塑活动。上述低温下表达量显著上升的5个冷诱导候选基因的获得为今后进行不耐低温鱼类的基因工程育种提供了基因元件。     

人HCN2真核表达载体的构建及在HEK293细胞中的表达

目的：构建含有人HCN2基因的真核表达载体,并观察在人胚胎肾细胞（HEK293）中的表达情况。方法：对人HCN2基因全序列进行分析,进行oligo设计,通过PCR,扩增HCN2全长cDNA,通过双酶切（XhoI和BamHI）装入真核表达载体pIRES2-EGFP中,脂质体法转染入HEK293细胞中,利用真核表达载体中带有绿色荧光蛋白GFP报告基因,对转染效率进行监测,采用反转录-聚合酶链反应检测HCN2 mRNA表达,全细胞膜片钳技术检测HCN2通道电流。结果：测序及酶切结果表明HCN2基因正确,荧光显微镜下,转染细胞观察到绿色荧光,反转录-聚合酶链反应检测到HCN2 mRNA表达,膜片钳检测到hHCN2基因编码的通道电流。结论：成功地构建了HCN2真核表达载体并进行了起搏通道HCN2基因的异源性表达。     

丹江口水库鲤肠道寄生蠕虫群落结构与季节动态

2004年2月到2005年11月在丹江口水库库区206尾鲤(Cyprinus carpio)肠道中检获蠕虫11种,其中复殖吸虫3种,线虫5种,棘头虫2种,绦虫1种。总体感染率为45.63%,平均感染丰度为4.23±12.65,平均感染强度为9.29±17.48,其中饭岛盾腹吸虫(Aspidogaster ijimai)的总感染率(25.24%)和平均感染丰度(1.76±6.46)最大,瓣睾鲫吸虫(Carassatrema lamellorchis)的感染强度(25.00±46.68)最大。除部分平均感染丰度较低的线虫如鲤带巾线虫(Cucullanus cyprini)外,其他蠕虫的分布类型均为聚集分布,蠕虫群落多样性指数为4.63,均匀度指数为0.60,对群落多样性的季节动态分析表明,各季节群落多样性和均匀度波动较大,并无明显变化规律。每尾鲤感染蠕虫种数多在1—4种之间,所有感染的11种蠕虫中优势种为饭岛盾腹吸虫;次优势种为日本侧殖吸虫(Asymphylodora japonica)、中华许氏绦虫(Khawia sinensis)、瓣睾棘吸虫和鲤长棘吻虫(Rhadinarhynchus cyprini);非优势种为对盲囊线虫(Contracaecum sp.)、鲤带巾线虫、鲤杆咽吸虫(Rhabdochona cyprini)、黄颡刺盖线虫(Spinitectus gigi)、毛细线虫(Capillaria sp.)和木村小棘吻虫(Micracanthorhynchina motomurai)。在种间协调关系方面,鲤杆咽线虫和瓣睾鲫吸虫、鲤长棘吻虫和饭岛盾腹吸虫、对盲囊线虫和木村小棘吻虫、鲤长棘吻虫和木村小棘吻虫之间分别存在显著正关联。对优势种和次优势种蠕虫中种群的季节动态分析表明,鲤寄生蠕虫各组分的感染率和平均感染丰度存在显著的季节差异,在秋、冬季节的感染水平普遍比较高,而到春夏则急剧下降,但中华许氏绦虫无显著季节变化。     

菘蓝二倍体及其同源四倍体遗传差异的ISSR分析

以1个菘蓝二倍体及其10个同源四倍体株系为材料,利用19个随机扩增ISSR引物分析其遗传差异性,为菘蓝多倍体诱变的基因表达调控以及遗传改良提供依据。结果显示:菘蓝二倍体与其同源四倍体及四倍体之间的ISSR多态性有明显差异,除主要遗传位点相同外,有些四倍体株系扩增条带数多于二倍体,有些四倍体株系扩增条带数少于二倍体,四倍体株系间亦有多态位点;11个株系共扩增111条多态性条带,多态性达55.22%。聚类分析显示,不同四倍体株系与二倍体的遗传差异大小亦不同。研究表明,菘蓝二倍体与其同源四倍体具有中等偏高的遗传差异性。     

斑叶蒲公英的核型分析和花粉母细胞的减数分裂观察

采用根尖压片法确定斑叶蒲公英的染色体数目,通过分析斑叶蒲公英核型及花粉母细胞减数分裂过程,以确定其倍性水平。结果表明:(1)斑叶蒲公英根尖细胞染色体数目为32条,核型公式为2n=3x+x′=32=(18m+6sm)+(3m+4sm+1T),属于2A型。(2)斑叶蒲公英花粉母细胞减数分裂为同时型胞质分裂,四分体的排列方式以正四面体型居多,十字交叉型偏少,偶见左右对称型。(3)前期Ι染色体的构型复杂,中期Ι和中期Ⅱ有赤道板外染色体;后期Ι和后期Ⅱ出现落后染色体、染色体桥及断片;后期Ⅱ和末期Ⅱ还出现染色体分离不同步及不均等分裂的现象;四分体时期出现二分体、三分体、含微核的异常四分体及多分体等异常现象。(4)对其花粉进行离体萌发试验,花粉萌发率只有26.3%,说明斑叶蒲公英是异源四倍体,32条染色体不均等的减数分裂异常,造成花粉活性较低。     

镜鲤骨骼肌酵母双杂交cDNA文库的构建及鉴定

为了研究蛋白质之间的相互作用,利用Gateway技术构建了镜鲤(Cyprinus carpio Linnaeus)骨骼肌酵母双杂交cDNA文库.经检测表明,构建的初级cDNA文库的库容量为8×106CFU;酵母双杂交cDNA文库的库容量为6.64×106CFU,插入片段集中在1-2 kb之间,具有较好的多态性.随机挑取的24个克隆没有空载体,全部发生了重组.较高的库容量、较长的插入片段以及较高的重组率保证了文库的完整性和覆盖度.镜鲤骨骼肌酵母双杂交cDNA文库的构建为克隆全长目的基因及研究影响骨骼肌发育的信号传导通路奠定了基础.     

秋水仙碱诱导甘草四倍体的研究

以胀果甘草成熟种子为材料,消毒后在培养皿中萌动处理12 h、24 h、36 h,用浓度为0.05%、0.075%、0.10%的秋水仙碱处理12 h、24 h、36 h,来进行四倍体的诱导,并对诱导处理后获得的再生植株进行染色体鉴定。结果表明:种子萌动处理24 h后,用浓度为0.075%的秋水仙碱溶液处理24 h诱导效果最好,变异率为41%。其体细胞染色体数目由2n=2x=16变为2n=4x=32。     

Streptomyces sahachiroi ATCC 33158中孢子色素合成基因簇(sah)的鉴定

【目的】Streptomyces sahachiroi ATCC 33158全基因组测序后,通过生物信息学分析找到一个II型聚酮合酶(polyketide synthase,PKS)基因簇sah。我们通过基因敲除和异源表达的方法对sah的生物学功能进行了研究。【方法和结果】对sah基因簇ORF(open reading frame)进行分析后发现,除了一个额外的氧甲基转移酶基因sahI以外,该基因簇与天蓝色链霉菌中负责孢子色素合成的基因簇whiE具有很高的相似性。将sah中负责后修饰的3个基因sahG、sahH和sahI分别敲除后,发现孢子色素的颜色随之发生明显的变化。将sah-minimal PKS基因和whiE-minimal PKS基因分别导入变铅青链霉菌ZX1中进行异源表达,高效液相色谱及液质联用分析证实它们产生相同的水溶性红色色素物质。【结论】sah与whiE基因簇具有相似的生物学功能,负责链霉菌孢子色素的合成。这两个基因簇所合成的孢子色素具有相同的母核,差别在于sah基因簇中多了一个编码氧甲基转移酶的后修饰基因,这可能是导致两种链霉菌孢子在颜色上有细微差别的原因。     

鲤幼鱼标准代谢率的个体差异与运动性能和摄食代谢的关系

为考察鲤科鱼类种内个体标准代谢率的差异及其与运动性能和摄食性能的内在关联,本研究以我国广泛分布的鲤(Cyprinids cardio)幼鱼[体重(4.79±0.08)g,n=36]为实验对象,在(25.0±1.0)℃下分别测量实验鱼的标准代谢率(SMR),随后测定单尾鱼的特殊动力作用(SDA)、自发运动、临界游泳速度以及活跃代谢率(MO2active)。实验鱼标准代谢率(SMR)的变幅为76.7~317.6 mg/(kg·h),其变异系数(CV)达24.4%;实验鱼在10 min内的尾鳍摆动次数(P0.05)和摄食代谢峰值(P0.05)均与标准代谢率(SMR)呈正相关;活跃代谢率(MO2active)(P0.05)与摄食代谢峰值以及活跃代谢范围与摄食代谢范围(P0.05)均呈正相关。然而,鲤幼鱼的标准代谢率(SMR)与相对临界游泳速度、活跃代谢率(MO2active)、特殊动力作用(SDA)时间和特殊动力作用(SDA)总量均不相关(所有P0.05)。研究表明,较高标准代谢率(SMR)的鲤幼鱼个体表现较高的活跃性和较强的摄食代谢能力,可能有助于其更易发现食物、逃避天敌以及加快食物处理。     

鲫幼鱼(Carassius auratus)标准代谢个体差异与力竭后代谢特征及行为的关联

为考察鲫(Carassius auratus)幼鱼标准代谢的个体差异与运动力竭后代谢特征和行为的关系,在(25.0±0.5)℃条件下测定80尾鲫幼鱼标准代谢率(SMR),筛选出40尾实验鱼[体重(13.54±0.20)g,体长(8.05±0.07)cm],其中包括20尾高SMR个体和20尾低SMR个体,测定运动至力竭实验鱼的最大代谢率(MMR),并计算代谢空间(AS=MMR-SMR)、相对代谢空间(FAS)和过量耗氧(EPOC)总量,随后测定单尾鱼的快速启动行为[反应时间(RT)、最大线速度(Umax)、最大线加速度(Amax)和120ms移动距离(S120)]以及个性行为(勇敢性和活跃性)。结果显示鲫幼鱼的SMR与AS、FAS和EPOC总量均呈负相关,而与MMR不相关;MMR与AS、FAS和EPOC总量均呈正相关;协方差分析显示高SMR个体组的代谢恢复速率与低SMR个体组无显著差异。鲫幼鱼的SMR与快速启动行为的RT呈正相关,与Amax呈负相关,而与Umax和S120均不相关。在快速启动行为中,鲫幼鱼的RT与Umax、Amax和S120均呈负相关,而Umax与Amax和S120呈正相关。鲫幼鱼的SMR与其勇敢性指标如潜伏期(L)、曝露时间(ET)和探头频率(AF)以及活跃性指标如运动时间比(PTM)、撞墙频率(FHW)均不相关,但鲫幼鱼的PTM与FHW和ET呈正相关。研究表明在实验室条件下鲫幼鱼的能量代谢特征、快速启动和个性行为存在明显的个体差异现象,并且部分表型特征之间存在权衡,提示这些权衡可能是鲫幼鱼的生理、行为与栖息环境相互作用的综合结果。