嗜盐菌Halobacterium species NRC-1不同盐浓度下基因表达差异分析

用RNA随机起始PCR（RAP—PCR）技术分析了盐杆菌NRC-1（Halobacterium NRC-1）不同NaCl盐度下基因表达的差异。81条引物用于比较17％、30％两种盐度下基因表达的差异,每条引物平均可以产生10条以上扩增条带,共得到15条在2种盐度下差异表达的条带,这些差异扩增条带的获得将有助从分子水平上了解Halobacterium NRC-1在高盐环境下的适应机制。     

基于蛋白质反式剪接的双载体凝血Ⅷ因子基因转移

以intein的蛋白反式剪接为工具,研究了运用双载体的真核细胞凝血Ⅷ因子（FⅧ）基因转移,通过翻译后剪接得到完整的功能性FⅧ蛋白.将B结构域大部分缺失（Δ761~1639）的人功能性FⅧ（BDD-FⅧ）cDNA于剪接所需保守残基Ser1657前断裂为重链和轻链,分别与106和48个氨基酸的mini Ssp DnaB intein的N端（IntN）和C端（IntC）编码序列融合,构建一对在质粒pcDNA3.1的强启动子CMV驱动下的真核表达载体.用脂质体共转染至293细胞和COS-7细胞,培养48h后,收集细胞上清,用ELISA检测培养上清中剪接形成的BDD-FⅧ蛋白水平,用Coatest法检测上清的功能性FⅧ生物活性,并用Western blot观察细胞内的BDD-FⅧ蛋白质剪接.结果显示,两种细胞培养上清中有较高水平的剪接BDD-FⅧ蛋白形成,分别达到（137±23）和（109±22）ng/mL,由细胞内和细胞外（培养上清）的剪接共同组成 并检测到培养上清中较高水平的FⅧ生物活性,分别为（1.05±0.16）和（0.79±0.23）IU/mL,包括细胞内、外剪接产物BDD-FⅧ共同形成 细胞总蛋白的Western blot进一步显示共转染后细胞内高效剪接形成的BDD-FⅧ蛋白.表明intein可用于双载体系统真核细胞FⅧ基因转移,并不完全依赖细胞内的剪接产生具有高FⅧ生物活性的BDD-FⅧ蛋白,为进一步在甲型血友病基因治疗研究中应用双腺相关病毒载体（AAV）转运FⅧ基因,克服AAV载体的容量限制提供了依据.     

营养物质对桑黄菌丝生物量及胞外多糖产量的影响

研究了不同碳源、氮源和无机盐对桑黄深层培养菌丝生物量和胞外多糖产量的影响,结果表明：在培养温度为26℃、摇床转速为160r／min、发酵时间为10d的条件下,以桑黄菌丝生物量为指标,最适碳源、氮源和无机盐分别是果糖或葡萄糖、酵母粉或酵母膏、KH2P04或MgSO4·7H2O;菌丝生物量分别达到1．51、1．31、1．69、1．52、1．52、1．36g／100mL;以胞外多糖为指标,最适碳源、氮源和无机盐分别是葡萄糖、酵母膏、ZnSO4·7H2O,胞外多糖产量分别达到0．49、0．45、0．22g／100mL。     

三棱的化学成分研究

目的：研究三棱Sparganium stoloniferum Buch．-Ham．的化学成分。方法：采用硅胶柱层析,Sephadex LH-20,ODSC-18,重结晶等方法,根据理化性质和光谱鉴定化合物的结构。结果：从三棱中得到8个化合物,分别为棕榈酸（1）,5-羟甲基糠醛（2）,6,7,10-三羟基-8-十八烯酸（3）,棕榈酸单甘油酯（4）,5-Hydroxy-2-（hydroxymethyl）pyridine（5）,β-谷甾醇（β-sitosterot）（6）,β-胡萝卜苷（daucosterol）（7）,Betulinic acid（8）。结论：化合物5,8为首次从该植物中分离得到。     

Caveolin-1基因沉默促进乳腺上皮细胞ERα36 介导的PI3K/AKT信号通路的激活

Caveolin-1(窖蛋白-1)单倍不足可以促进正常乳腺细胞的早期转化, 与新型雌激素受体亚型ERα36介导的膜始动雌激素信号通路的激活有关, 但是关于其机制并未被研究清楚. 本文利用siRNA技术建立了Caveolin-1低表达而ERα36高表达的稳定传代细胞模型MCF10ACE, 采用基因芯片技术检测了ERα36高表达时雌激素信号通路基因表达谱, 研究了ERα36在雌激素激活的PI3K/AKT信号通路中的作用及其与乳腺细胞转化的关系. 结果表明: (1) Caveolin-1表达降低时可以以雌激素依赖性方式促进ERα36表达增加; (2) ERα36高表达可介导MCF10ACE细胞雌激素抗凋亡信号通路(PI3K/AKT)的激活, 促进其与增殖信号通路MEK/ERK之间的交叉对话, 从而使人乳腺细胞增殖加快, 逐渐转化. 结果提示, Caveolin-1与ERα36相互作用调节膜起始的雌激素信号通路是控制乳腺细胞转化的重要机制.     

重组人粒细胞集落刺激因子的N端氨基定点PEG化修饰

尽管重组粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)具有重大的治疗价值,然而在实际应用却受到体内半衰期过短因而需要频繁重复注射的限制．为了解决这一问题,我们利用两种不同分子量（5 kD和 20 kD）的单甲氧基聚乙二醇丙醛（mPEG-PAL）对rhG-CSF的N端氨基进行了定点PEG化修饰．通过正交实验的统计学方法得到了最适修饰条件．研究发现,PEG化后的rhG-CSF具有了更高的体外稳定性,其体内活性也得到了很大提高,体内作用时间得到很大延长．因此,对于rhG-CSF的N端氨基定点PEG化修饰,可以显著提高rhG-CSF的临床应用价值．     

枯草杆菌可溶性YlyA蛋白的诱导表达与纯化研究

YlyA是枯草杆菌一种功能未知蛋白.本研究旨在建立可溶性YlyA的诱导表达体系和纯化方法,为其功能研究奠定基础.PCR扩增ylyA序列,将其克隆到pETMCSⅢ中构建表达载体pNG252,用IPTG诱导6×His-YlyA融合蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,对表达产物进行分析,最后对可溶性YlyA重组蛋白进行Ni2+-WTA亲和层析加以纯化.结果表明pNG252中ylyA的插入方向正确,序列无突变;用0.5 mmol/L IPTG,37℃诱导3 h时,YlyA虽高效表达,但为包涵体形式;调整诱导条件至0.05 mmoL/L IPTG,25℃,5 h时,高效表达的YlyA部分转为可溶性蛋白.纯化后的YlyA浓度达204.2119 μmoL/L;调整洗涤液中的咪唑浓度至15 mmol/L,pH至9,可使纯化蛋白的产量大幅提高.本文成功构建了YlyA高效可诱导表达载体,建立了可溶性蛋白的诱导表达条件,确立了Ni2+-NTA亲和层析纯化方法,所得的6×His-YlyA融合蛋白,可用于YlyA晶体结构和与功能分析.     

鼻咽癌组织中氧化性DNA损伤标志物8-硝基鸟嘌呤和8-羟基脱氧鸟苷的检测及与iNOS的关系

8-硝基鸟嘌呤（8-nitroguanine, 8-NitroG）和8-羟基脱氧鸟苷（8-hydroxy-2′-deoxyguanosine, 8-OHdG）是2个氧化性DNA损伤生物标志物,而诱导型一氧化氮合酶(iNOS)在病理状态下催化细胞合成与氧化性DNA损伤有关的 氧自由基NO.本研究通过检测鼻咽癌组织中8-NitroG、8-OHdG和iNOS的免疫反应强度,初步探究鼻咽癌的发生和发展是否与氧化性DNA损伤有关以及8-NitroG、8-OHdG与iNOS表达的关系.利用多克隆抗体8-NitroG和单克隆抗体8-OHdG、iNOS,采用双色荧光免疫组织化学方法检测鼻咽癌组织中8-NitroG、8-OHdG和iNOS的免疫反应,秩和检验统计学方法分析鼻咽癌和慢性咽炎鼻咽组织之间8-NitroG、8-OHdG和iNOS免疫反应强度的差异.结果显示,19例鼻咽癌组织细胞中,8-NitroG、8-OHdG和iNOS均为强免疫反应,8-NitroG和8-OHdG阳性率100%,iNOS阳性率94.7 %,与13例慢性咽炎组织比较差异显著(P.<0.05).结果提示,鼻咽癌的发生和发展与氧化性DNA损伤有关,其原因与炎症等病理刺激下鼻咽组织高表达的iNOS催化细胞合成氧自由基NO引起的8-NitroG和8-OHdG DNA损伤密切相关.另外,8-NitroG和8-OHdG有望成为辅助鼻咽癌诊断的生物标志物.     

人源FGF-21在脂肪细胞糖代谢中的作用

近年来研究发现,成纤维细胞生长因子(FGF)-21是一种新的代谢调节因子.为了深入研究人源FGF-21（hFGF-21）的生物活性,本实验利用SUMO高效表达载体,高效表达成熟的hFGF-21,并利用小鼠3T3-L1脂肪细胞检测hFGF-21的糖代谢活性．实验结果表明,hFGF-21可促进脂肪细胞的葡萄糖吸收,且葡萄糖吸收效率呈剂量依赖性．hFGF-21作用4 h即可促进脂肪细胞糖吸收,其活性可持续24 h以上．hFGF-21与胰岛素共同作用的葡萄糖吸收效果,明显优于它们的单独作用结果,说明hFGF-21与胰岛素发挥协同作用．脂肪细胞经hFGF-21预处理后,显著增加了胰岛素促进脂肪细胞吸收葡萄糖的效率,说明hFGF-21可以增加胰岛素的敏感性．本实验为临床应用hFGF-21治疗糖尿病,增加胰岛素敏感性提供了依据．