聚乳酸纳米粒穿透血脑屏障的分析电镜研究

观察以聚乳酸 (D ,L-polylacticacid,PLA)为材料制备、经吐温-80(T-80)表面改性的纳米粒对血脑屏障的穿透效果并探讨其机制 ,分别将FITC-Dextran、叶绿素铜作为PLA纳米粒的示踪标记 ,应用荧光显微镜、透射电镜及分析电镜观察经静脉注射入小鼠体内的PLA纳米粒在脑组织中的分布、穿透血脑屏障的特性。荧光显微镜观察到小鼠脑组织中散在及沿毛细血管壁分布的荧光颗粒 ,透射电镜可观察到小鼠脑毛细血管内皮细胞及周围脑组织中圆形或类圆形的外源性纳米粒 ;进一步采用分析电镜对颗粒处组织进行能谱分析证实其为叶绿素铜标记的PLA纳米粒。证实了T-80修饰的PLA纳米粒具有穿透血脑屏障的特性 ,机制可能是毛细血管内皮细胞的胞吞转运作用 ,同时 ,为研究纳米粒在组织内的定位提供了新的标记方法.     

苏云金芽孢杆菌伴孢晶体20kb DNA中cry1Ac基因的克隆、高效表达和生物活性研究

已经证实苏云金芽孢杆菌 (Bacillusthuringiensis,Bt)伴孢晶体结合 2 0kbDNA ,但其序列特异性及作用有待进一步研究阐明。研究了选择性溶解Bt 4.0718菌株Cry1类原毒素所形成的菱形伴孢晶体 ,从中抽提出与其结合的 20kbDNA。经NdeⅠ酶切消化后亚克隆构建文库 ,通过PCR-RFLP及测序筛选出含cry1Ac基因的转化子。然后设计引物PCR扩增出cry1Ac基因的ORF并与pET30a连接 ,转化E .coliBL21(DE3) ,高效表达了14.1kD蛋白。表达蛋白占总蛋白量的50%以上 ,且 90 %以上以包涵体形式存在。利用穿梭载体pHT30.4构建表达质粒pHTX42 ,电转化Bt无晶体突变株XBU001,获得重组菌株HTX42 ,经SDS-PAGE分析 ,cry1Ac基因得到强表达 ,蛋白质定量分析显示目的蛋白量占总蛋白量的79.28% ,且其在细胞中累积达细胞干重的6.413% ,比文献报道的25%左右高了 1倍以上。原子力显微镜 (AtomicForceMicroscopy ,AFM)检测显示 ,目的基因在大肠杆菌(E.coli)中表达的包涵体呈不规则形状且较小,而在无晶体突变株中表达的晶体呈典型菱形晶体,大小约为1.2μm×2.0μm.生测结果显示,包涵体与晶体对小菜蛾(Plutella xylostella)幼虫均有高效杀虫活性。本研究为构建高效杀虫工程菌及进一步阐明Bt伴孢晶体中20kb DNA分子的来源,结构和功能奠定了重要的基础。     

人端粒结合蛋白TRF1的克隆、表达和抗体制备

利用RT-PCR技术,从HeLa细胞的cDNA文库中扩增到人端粒结合蛋白1(hTRF1)基因编码区序列,克隆至pUCm-T载体,测序正确后,构建带His₆-tag原核表达载体pET-28c-TRF1,经IPTG诱导表达的His₆-TRF1融合蛋白分子量约为65kD,Western-blot证实表达产物可特异地与TRF1抗体sc-6165结合。用Ni^2＋NTA胶亲和层析纯化可得到电泳均一的融合蛋白,免疫新西兰纯种大白兔,获得特异性好的多克隆抗体,该抗体可用于免疫荧光染色和Western-blot方法检测哺乳动物细胞内源性的TRF1分子。     

RNA干扰抗HIV-1的基本策略及其优化

艾滋病已成为严重威胁人类健康的疾病之一,而目前仍未找到行之有效的预防及治疗方法.RNA干扰是近年来发现的一种简单高效的基因干预方法,在病毒、肿瘤及功能基因组学等研究方面已显示出良好的应用前景.     

鲎血细胞中脂多糖结合蛋白TALF在大肠杆菌中的表达研究

TALF(Tachyleus antilipoposaccharide factor)对细菌内毒素（LPS）的核心部分有抑制作用。研究TALF cDNA基因在大肠杆菌中的表达,首先将TALF cDNA基因分别插入大肠杆菌表达载体pGEX-4T-2、pET22b、pET28a中,构建重组表达质粒,转化于大肠杆菌BL21(DE3)。结果表明克隆于pET22b、pET28a中的TALF cDNA基因没有表达,而融合了GST的TALF基因（GST-TALF）能够在大肠杆菌中表达,并形成包涵体。从1L培养基中可获得4mg纯度为91%的GST-TALF融合蛋白。经复性和纯化后的融合蛋白GST-TALF几乎检测不到抑菌活性及LPS中和活性,但该融合蛋白经凝血酶消化后表现出明显的体外抑菌活性及LPS中和活性。     

富含脯氨酸小蛋白-2在小鼠子宫中的表达及调节

富含脯氨酸小蛋白(Sprrs)参与构建复层扁平上皮的角化细胞壳（CE）,它们在子宫单层上皮中的作用还不清楚.采用RNA印迹和半定量RT-PCR方法,研究了Sprr2在小鼠动情周期和妊娠子宫中的表达及其激素调控.实验结果发现:Sprr2在动情前期和动情期表达上调,而动情后期和间情期表达下调.在妊娠初期表达迅速下调,直至临产期表达重新受到诱导并在产后达到高峰.鉴于其在不同生殖阶段子宫中独特的表达模式和在复层上皮中保护性的功能,推测Sprr2与子宫对交配和分娩所产生的应激反应有关.     

60Co辐射对网织红细胞微观流变学特性的影响

采用 ⁶⁰Co大剂量全身均匀急性辐射的方法,造成一种辐射贫血的动物模型.以便在几天内连续研究 ⁶⁰Co辐射对新生的网织红细胞及红细胞流变学特性的影响.采用一种在低粘切变流场中能将红细胞变形指数DI分解为取向指数（DI）_or和小变形指数（DI）_d的新型激光衍射法,对网织红细胞及红细胞的变形指数、取向指数、综合变形指数（IDI）等血液流变学特性参数进行测量,发现在 ⁶⁰Co大剂量辐射后,新生的网织红细胞及红细胞流变学特性存在明显异常.将这种 ⁶⁰Co辐射造成的贫血模型与文宗曜等提出的用抗体诱导的大量同步化的球形红细胞贫血模型相比较,后者更具有明显的优点.同时为研究辐射对血液流变特性的影响及正确地挑选红细胞衰老模型提供了理论与实验的基础.     

用少量样本进行抑制性消减杂交

利用根据cap-finder方法建立的全长cDNA合成技术,扩增获得了恒河猴着床点子宫内膜组织表达mRNA的双链cDNA,通过抑制性消减杂交,成功地构建了恒河猴着床点消减文库.随机挑选文库中的阳性克隆,经点杂交证明27％为着床点差异表达的克隆.由此表明抑制性消减杂交结合cap-finder扩增全长cDNA的方法,可以有效地从少量而珍贵的样本中获得高质量的消减文库.     

巨峰葡萄花芽分化的研究

以巨峰葡萄(Vitis vinifera L.×V.Labrusca L.cv.Kyoho)为材料,用摘叶、去穗法判定花芽的生理分化期,并用GMA半薄切片法观察花芽分化进程。结果表明:从新梢顶端到第9个展开叶之间的芽处于生理分化期,花芽生理分化期分为成花诱导期和花芽孕育期。葡萄的花序分化阶段可分为未分化期、花序原基分化期和花序第二穗轴分化期3个时期。第1年只进行花序分化,次年进行花器官分化。原分生组织衍生的组织中淀粉粒分布较多,蛋白质则在分裂旺盛的原基组织中含量高。     

鸡传染性法氏囊病病毒超强毒上海株SH95基因组B片段的克隆与分子系统进化树分析

分离、纯化了鸡传染性法氏囊病病毒超强毒(vvIBDV)上海株(SH95)的病毒核酸dsRNA,应用随机引物将RNA反转录成cDNA,以此为模板一步扩增出全长基因组B片段,将其克隆入pGEM—T载体,并进行序列分析。克隆的B片段全长2827个核苷酸,其编码的氨基酸与超强毒株HK46的同源性达98．18％(863／879)。分子系统进化树分析表明,SH95超强毒株与美国变异株E的亲缘关系最近,但与基于基因组A片段的系统进化分析完全不同,表明该毒株在发生过程中基因重配比基因重组发挥了更重要的作用。通过对14株IBDV编码氨基酸序列的分析、比较,推测B片段上11个独特的氨基酸位点可能与毒力相关。