抗菌肽克隆基因的表达和转基因研究现状

抗菌活性肽具有抗细菌、真菌、病毒、原虫,还有杀精子活性和抑癌活性,具有潜在的应用价值。本文介绍国内外克隆抗菌肽基因的表达研究状况以及抗菌肽在基因植物、动物方面的应用成果存在的问题。     

鲤鱼生长激素在毕赤酵母中的表达

 将编码鲤鱼 (Cyprinuscarpio )生长激素 (GH)成熟肽的cDNA克隆到毕赤酵母 (P .pastoris)胞内表达载体pHIL D2中 ,构建重组表达质粒pHIL D2 GH .转化组氨酸缺陷型酵母GS115,获得表达鲤鱼GH的酵母工程菌 .经甲醇诱导 ,SDS PAGE和Western印迹检测表明 ,鲤鱼GH在酵母中得到表达 ,表达产物在胞内以可溶状态存在 ,具有鲤鱼GH的免疫活性 .用诱导后的酵母投喂罗非鱼 ,实验结果证实所构建的工程菌具有明显的促生长作用     

深海放线菌Actinomadura sp.01119的代谢产物研究

采用硅胶柱色谱、制备薄层色谱和凝胶色谱等分离方法,对分离自深海沉积物中的海洋放线菌Actinomadura sp.01119的代谢产物进行研究,从中分离得到9个化合物,经1H NMR、13C NMR和MS等波谱分析并结合相关文献鉴定为环(L-苯丙-L-脯)二肽(1),环(L-脯-L-脯)二肽(2),环(L-酪-L-脯)二肽(3),环(D-酪-L-脯)二肽(4),环(L-异亮-L-脯)二肽(5),环(L-缬-L-脯)二肽(6),棕榈酸(7),对羟基苯甲酸(8),尿嘧啶(9)。其中化合物1~6为环二肽类化合物。     

酪蛋白激酶Iα与细胞信号通路

酪蛋白激酶Ⅰα(Casein kinase 1α,CK1α)广泛分布于各类真核生物中,是CK1家族的7个成员(CK1α、β、γ1、γ2、γ3、δ和ε)之一,序列结构高度保守。在哺乳动物中,CK1α参与多种细胞生理过程,包括膜转运,细胞周期,染色体分离,细胞凋亡和细胞分化等。此外,CK1α还参与Wnt/β-Cat,Hh及NF-κB等信号通路。将CK1α在各类信号通路的具体功能作一综述,为进一步研究其在信号通路中的地位提供参考。     

B族G蛋白偶联受体PAC1可调控表达体系的建立

PAC1是神经肽垂体腺苷酸环化酶激活多肽(Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide,PACAP)的特异受体,属于B族G蛋白偶联受体,介导PACAP的神经递质、神经调质、神经保护、抗神经损伤及调控神经再生等功能,PAC1高表达和神经损伤、肿瘤等生理病理过程密切相关。为了深入了解PAC1的功能,构建PAC1可调控表达的细胞系,通过优化的四环素控制表达系统实现PAC1在中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)细胞的强力霉素(doxycycline,Dox)依赖的可控表达。首先通过双酶切将编码PAC1和增强型黄色荧光蛋白(EYFP,enhanced yellow fluorescent protein)的融和基因PAC1-EYFP克隆到pTRE-Tight载体上,获得重组载体pTRE-PAC1-EYFP;基因测序鉴定正确后将新型的四环素调节元件载体pTet-on advanced和反应元件载体pTRE-PAC1-EYFP分别转入CHO细胞中,G418和潮霉素(Hygromycin)双抗筛选阳性克隆PAC1-Tet-CHO,使用梯度浓度四环素类似物强力霉素Dox诱导PAC1-EYFP表达,48 h后检测受体表达水平,并通过MTT法检测不同PAC1表达水平的细胞增殖活性。荧光检测和Western印迹结果显示,成功获得了具有良好诱导性的Dox依赖的PAC1可控表达的细胞系,这些细胞株在传10代后仍能稳定地可控表达PAC1。MTT结果显示PAC1表达水平越高,细胞增殖活性越强。成功所构建的Dox依赖的PAC1可控表达细胞系,为PAC1的生物学功能的深入研究奠定了基础。     

葡萄糖氧化酶的有机相共价固定化

将葡萄糖氧化酶(GOD)在最适pH条件下冻干后,以戊二醛活化的壳聚糖为载体,分别在传统水相和1,4-二氧六环、乙醚、乙醇三种不同的有机相中进行共价固定化。通过比较水相固定化酶和有机相固定化酶的酶比活力、酶学性质及酶动力学参数,考察酶在有机相中的刚性特质对酶在共价固定化过程中保持酶活力的影响。结果表明,戊二醛浓度为0.1%、加酶量为80 mg/1 g载体、含水1.6%的1,4-二氧六环有机相固定化GOD与水相共价固定化GOD相比,酶比活力提高2.9倍,有效酶活回收率提高3倍;在连续使用7次后,1,4-二氧六环有机相固定化GOD的酶活力仍为相应水相固定化酶的3倍。在酶动力学参数方面,不论是表观米氏常数,最大反应速度还是转换数,1,4-二氧六环有机相固定化的GOD(Kmapp=5.63 mmol/L,Vmax=1.70μmol/(min.mgGOD),Kcat=0.304 s-1)都优于水相共价固定化GOD(Kmapp=7.33 mmol/L,Vmax=1.02μmol/(min.mg GOD),Kcat=0.221 s-1)。因此,相比于传统水相,GOD在合适的有机相中进行共价固定化可以获得具有更高酶活力和更优催化性质的固定化酶。该发现可能为酶蛋白在共价固定化时因构象改变而丢失生物活性的问题提供解决途径。     

微RNA在卵巢上皮性癌发生发展中作用及其临床意义

研究表明,miRNA参与了胚胎发育、损伤修复、糖尿病、心脏病等许多重要生理病理过程,特别是在恶性肿瘤的发生发展中发挥了重要作用,并具有潜在的临床意义。本文比较详细地叙述了有关miRNA的重要基础研究成果,并就miRNA在卵巢癌组织及细胞中的表达、miRNA在卵巢癌发生发展中的作用、miRNA与卵巢癌早期诊断、化疗耐药及预后判断等方面的最新研究成果进行了综述。     

新型仓贮超声雾化熏蒸装置的研制

针对目前粮食仓贮熏蒸剂(即磷化氢)防虫不防霉,且施用时对环境和操作人员均存在安全隐患的现状,为将具有自主知识产权的纯天然驱虫抗霉复合精油产品很好地应用于仓储领域,一款新型仓贮超声雾化熏蒸装置被设计研制,并在国家级标准粮库微缩模型(1∶200)中进行相关功能技术参数测定。结果显示,样机在常温下能连续工作48h,远大于实际所需要的工作时间;样品雾化后,工作区中分布的雾滴粒径为几个微米级;GC-MS分析证明雾化后复合精油的组分种类、比例及功效组分浓度没有改变,就整体而言具有一定的纯化作用;雾化的精油量与功率和时间均呈良好线性关系。上述数据说明,所研制的超声雾化装置完全适用于新型防虫抗霉复合精油的雾化,实际应用时若配合仓库鼓风系统雾化效果会更好。     

人源性抗体在HEK293T细胞中瞬时表达条件的优化

以HEK293T细胞为宿主对抗体基因的转染和表达条件进行优化。以GFP(green fluorescence protein)和人源性抗b FGF抗体1A2为报告基因,考察了3种转染试剂磷酸钙,PEI,FuGene HD的转染效率,确定FuGene HD的转染效率最高后,对DNA∶FuGene HD的比例,加入氯喹的浓度,转染后的孵育时间,最佳的低温培养温度以及加入组蛋白抑制剂的浓度进行了优化。结果显示,FuGene HD的转染效率最高,达到56.7%。当转染的DNA=2μg/4×106细胞时,DNA∶FuGene HD的最佳比例为1∶4(W/V);加入氯喹能够增强FuGene HD的转染效率,最佳浓度为100μmol/L,转染后的最佳孵育时间为6h;低温诱导能够提高293T细胞表达抗体的能力,最佳的温度为33℃;加入组蛋白抑制剂丁酸钠或丙戊酸能够明显提高抗体的表达量,丙戊酸的效果优于丁酸钠。通过对转染试剂,转染方法,培养温度,组蛋白抑制剂的加入等条件进行优化使人源性抗bFGF抗体的表达量从1.5mg/L提高到了15.1mg/L。     

微卫星标记在穿山甲个体识别中的应用

在对非法走私和捕杀穿山甲的犯罪案件研究中,所涉及的穿山甲个体数量是量刑的重要依据,然而对于一些穿山甲鳞片、肉块及其深加工产品,从形态学上却无法进行个体识别。微卫星标记已证实是一种用于动物个体识别的可靠的遗传标记。本研究从已发表的34对穿山甲微卫星引物中筛选出6对多态性较高的引物,用于穿山甲鳞片的个体识别。结果表明:6个位点的观测值杂合度(Ho)为0.653-0.234;期望值杂合度(He)为0.926-0.861;MJA03的PIC最高(0.918),MJA13的PIC最低(0.852),平均PIC为0.884。单个座位的个体识别能力在0.826-0.956之间,累积个体识别能力为99.9999%,表明采用的6个位点适用于国内穿山甲走私案中的个体识别。