一种通用型piggyBac转座子诱导细胞永生化载体的构建及其基本功能验证

为了构建一种高效、通用的细胞永生化载体pTP-hTERT,通过人工合成、PCR、酶切连接等方法,对传统piggyBac(PB)转座子系统进行改造。改造后的载体含有转座必需元件、PB转座酶(PBase)表达框、共表达筛选元件和人端粒逆转录酶(hTERT)基因表达框。其中筛选元件中绿色荧光蛋白(EGFP)基因和嘌呤霉素抗性(Puror)基因以猪捷申病毒2A自我剪切肽相连,以实现共表达。为验证载体元件功能,使用该载体转染HEK 293细胞,并对筛选出的阳性细胞进行RT-PCR、Western blotting(WB)、热不对称PCR(Tail-PCR)和细胞克隆亚甲蓝染色与统计分析。载体测序鉴定与细胞培养结果表明,通用型永生化载体pTP-hTERT构建成功,转染HEK293细胞后能筛选出抗嘌呤霉素细胞单克隆;WB结果显示P2A可高效切割EGFP和Puror融合蛋白,证明筛选标记基因功能正常;Tail-PCR结果表明该载体以转座整合插入宿主基因组;亚甲蓝染色统计结果显示由pTP-hTERT引发的细胞阳性克隆数与对照组相比显著提高(P0.01)。PB转座子永生化载体pTP-hTERT的构建为永生化细胞系的建立提供了工具,同时也为其他真核载体的构建和改造提供了参考。     

花烛叶色嵌合体不同生长阶段叶色性状的保持特征

对20个花烛叶色嵌合体株系在不同生长阶段的叶色性状保持特征进行观察,并通过计算机程序辅助分析发现:离体培养阶段,植株嵌合叶片总数占总叶片数的比率及平均单株非绿色部分占总叶面积的比率均为最高,分别为81%和50.1%,两项数值分别高于温室生长阶段新生嵌合叶数占新生叶片总数的比率(46.2%)及新生叶片非绿色部分占新生叶片总面积的比率(23.0%);移栽后,叶片非绿色部分比率超过50%的9个株系中有7个不能正常生长而死亡,所剩13个株系的新生叶片嵌合叶数减少,非绿色部分面积比率缩小,叶片趋向转为绿色;施用营养液后,5个株系的新叶非绿色部分面积比率回升。这些现象表明:营养条件充分有利于嵌合株系花叶性状的保持;嵌合株系中非绿色部分面积大于50%的株系生活力弱,不宜过早移栽;在茎尖分生组织形成叶原基的过程中,可能存在正常细胞与突变细胞的竞争,其结果是一方取代另一方或二者达到动态平衡。     

川西亚高山三种森林恢复途径对土壤生物有效磷的影响

土壤生物有效磷在提高森林生产力和生物地球化学循环中起着至关重要的作用,研究不同森林恢复途径对土壤生物有效磷的影响对于退化森林的适应性恢复和可持续经营具有重要意义。选取川西亚高山不同恢复途径下形成的3种森林类型,即粗枝云杉人工林（人工种植,PF）、岷江冷杉-红桦天然次生林（自然更新,NF）和粗枝云杉阔叶混交林（人工种植后自然更新,MF）,采用基于生物有效性的土壤磷分级方法测定土壤生物有效磷（CaCl₂-P、Citrate-P、Enzyme-P和HCl-P）,探究不同森林恢复途径对土壤生物有效磷的影响。结果表明：不同森林恢复途径对土壤生物有效磷影响显著（P<0.05）,NF和MF的土壤Citrate-P和Enzyme-P显著高于PF（P<0.05）,而PF的土壤HCl-P显著高于NF（P<0.05）。自然更新是3种森林恢复途径中最能提高土壤生物有效磷的方式。3种森林恢复途径下的土壤生物有效磷组分与速效磷均呈现显著的正相关关系,且NF的土壤速效磷与生物有效磷的相关性更强（CaCl₂-P除外）。显著影响NF土壤生物有效磷的土壤理化性质有全钾、铵态氮含量和pH值,且全钾对NF的土壤生物有效磷变异的解释程度最高（r²=0.63,P=0.001）。土壤pH值、钙和可溶性有机碳含量是显著影响MF土壤生物有效磷的主要土壤理化性质（P<0.05）。对PF的土壤生物有效磷具有显著影响的土壤理化性质是土壤有机碳、铁和可溶性有机碳含量。土壤理化性质对3种恢复途径下森林土壤生物有效磷的解释率均超过了80%,森林恢复途径对土壤生物有效磷的影响与土壤理化性质有关。     

成熟软骨细胞促进小鼠胚胎干细胞向软骨分化

为诱导胚胎干细胞向软骨细胞分化,采用胚胎干细胞与成熟软骨细胞共培养的方法以提供软骨诱导微环境．小鼠胚胎干细胞经初步分化,形成类胚体后,从中分选出Flk-1阳性细胞,其与猪关节软骨细胞混合后,接种于可降解材料支架,并植入裸鼠皮下．4周后经组织学检查及Ⅱ型胶原抗体免疫荧光检查证实,细胞材料复合物形成软骨组织．经小鼠主要组织相容性抗原染色,证实其中部分软骨细胞源自于小鼠胚胎干细胞．本研究建立了胚胎干细胞定向诱导分化的新方法．     

一种由寡核苷酸介导的大肠杆菌ftsZ基因无痕敲除的方法

现阶段,适用于大肠杆菌的无痕敲除方法普遍存在周期较长、操作步骤复杂等问题。为了进一步改进和优化无痕敲除技术,采用单链寡核苷酸介导的Red同源重组系统（single strand oligonucleotide-mediated recombineering,SSOR）,通过两步连续的同源重组,敲除了一种编码类似微管蛋白的GTP酶的ftsZ基因。该方法可快速高效无痕的敲除目的基因,为大肠杆菌基因组改造提供了有效方法,另外,ftsZ基因缺失株的获得也为研究ftsZ基因功能创造了条件。     

食用菌露地栽培技术的开发研究(二)——露地畦栽试验

凤尾菇、平菇的露地砖栽、袋栽方法在我国南方以及河南、河北等省己有成功的报导。但在天津地区高温多雨季节进行露地代料畦栽,实属新的尝试。为了在蔬菜淡季能够为市场提供新鲜的食用菌,我们在986年7月中旬至9月中旬,先后进行4批露地畦栽试验,并取得了予期结果,为我市郊县、农村充分利用房前屋后闲散空地,