营养对褐飞虱生长和繁殖信号通路的影响

【目的】昆虫感知外界营养状态,在体内营养信号通过许多信号通路进行传递,进而调控昆虫的生长和繁殖。本研究旨在为营养调控褐飞虱Nilaparvata lugens生长和繁殖的分子机制作出初步探索。【方法】在不同营养条件［100%浓度饲料(全纯人工饲料D-97, 对照)、50%浓度人工饲料和25%浓度人工饲料］下饲喂褐飞虱3龄第2天若虫至成虫,统计体重、发育历期、存活率和每卵巢成熟卵量;利用荧光定量PCR检测羽化后第2天褐飞虱成虫不同组织(卵巢、脂肪体和其他组织)中IIS, TOR以及AMPK信号通路相关基因(InR1, InR2, AKT, FoxO, TOR, S6K, 4EBP, AMPKα,AMPKβ和AMPKγ)的表达量;利用Western blot方法检测羽化后第6天褐飞虱成虫卵巢和其他组织中Akt, FoxO和AMPK蛋白磷酸化水平;同时检测羽化后第6天褐飞虱成虫不同组织中的ROS水平以及不同龄期褐飞虱体内保幼激素(juvenile hormone, JH)和蜕皮激素(20-hydroxyecdysone, 20E)滴度。【结果】与饲喂100%浓度人工饲料的对照相比,用低浓度人工饲料饲喂褐飞虱至成虫导致5龄第2天至成虫体重显著降低,从3龄第2天若虫至成虫发育历期缩短,死亡率提高,每卵巢成熟卵量显著降低。取食低浓度人工饲料后,羽化后第2天成虫IIS, TOR以及AMPK信号通路相关基因InR2, TOR, 4EBP, AMPKα在卵巢、脂肪体和其他组织中, AKT, S6K和AMPKγ在脂肪体和其他组织中,以及InR1, FoxO和AMPKβ在其他组织中表达量较对照均显著下降,但卵巢中InR1, AKT, FoxO和AMPKγ的表达量相对稳定;羽化后第6天成虫卵巢和其他组织中AKT, FoxO以及AMPK的磷酸化水平显著增加。随着人工饲料饲喂浓度的降低,羽化后第6天褐飞虱成虫不同组织中的ROS水平显著增加。不同营养条件下褐飞虱4龄第2天若虫体内JH滴度无显著差异,低营养条件下5龄第2天若虫体内JH滴度较对照显著降低,而在羽化后第2天成虫体内JH滴度则较对照显著增加;低营养条件导致褐飞虱若虫以及成虫体内20E滴度均显著增加。【结论】褐飞虱在面临营养缺失的情况下,营养信号传导通路(IIS, TOR以及APMK通路)的关键基因表达均下降,而ROS水平显著上升,通过调节AKT, FoxO以及AMPK的磷酸化水平,进而影响JH以及20E的生物合成。     

利用CRISPR/Cas9系统检测果蝇细胞中组蛋白甲基化修饰对20E信号传导的调控

【目的】利用CRISPR/Cas9基因敲除系统在黑腹果蝇Drosophila melanogaster细胞中筛选并检测组蛋白甲基化修饰对蜕皮激素20 羟基蜕皮酮(20-hydroxyecdysone, 20E)信号传导的调控。【方法】通过Flybase网站分析并总结黑腹果蝇组蛋白甲基转移酶及其修饰位点;将5个组蛋白甲基转移酶基因［trr, Mes-4, ash1, Su(var)3-9和egg］的sgRNA插入到敲除载体pAc-sgRNA-Cas9骨架中并转染黑腹果蝇Kc细胞,利用TA克隆和测序鉴定突变位点。以Trr正调控20E初级应答基因Br-C的转录表达为阳性对照,利用qRT-PCR和Western blot检测该系统敲除靶基因的有效性;通过检测20E应答元件(20E response element, EcRE)双荧光素酶活性确定trr, Mes-4, ash1, Su(var)3-9和egg是否参与20E信号传导。【结果】果蝇组蛋白甲基化修饰主要发生在组蛋白H3的赖氨酸残基上,H3的精氨酸残基和组蛋白H4的甲基化修饰较少。trr敲除载体pAc-trr-sgRNA-Cas9转染Kc细胞后成功突变trr,降低H3K4三甲基化水平并阻断20E对其初级应答基因Br-C的转录诱导,证明该敲除系统的有效性。除trr之外,Mes-4和egg的敲除降低EcRE的双荧光素酶活性。【结论】插入靶标基因sgRNA序列的pAc-sgRNA-Cas9敲除载体在果蝇Kc细胞中可以有效快捷地突变靶基因。利用该敲除系统发现,除Trr之外,Mes-4和egg影响EcRE的活性而参与20E信号传导。本研究为昆虫细胞CRISPR/Cas9介导的基因敲除和组蛋白甲基化修饰调控20E信号传导的深入研究提供了理论依据与工作基础。     

高寒草甸黄帚橐吾种群根际/非根际土壤可培养微生物群落特征

黄帚橐吾（Ligularia virgaurea）是高寒草甸常见的毒杂草,被认为是指示一个地区草地植被退化的重要物种,研究其根际/非根际土壤微生物在不同海拔梯度上的群落特征具有重要意义。以甘南州高寒草甸不同海拔梯度黄帚橐吾根际/非根际土壤可培养微生物为研究对象,采用稀释涂布平板法和最大可能数法（MPN）测定了土壤微生物的数量及土壤理化因子的变化。结果表明：细菌在微生物总数中占比最大,根际微生物数量随海拔升高呈先增加后减小的变化,非根际则表现为递增的趋势,微生物功能群在根际和非根际土壤中均逐渐增加;根际土壤的微生物和功能群数量均高于非根际土壤。RDA分析发现,土壤温度、有机碳、电导率、pH、全氮、全磷、速效氮及脲酶对根际/非根际土壤微生物数量及功能群变化影响较大。通径分析可知：根际土壤中,细菌和真菌受速效氮和有机碳影响较大,放线菌主要受土壤温度和电导率的影响;根际土壤固氮菌和氨化细菌决策系数速效氮 > 有机碳 > 全氮;根际和非根际土壤中硝化细菌的影响因子各不相同,根际土壤决策系数最大和最小分别为全磷和全氮,非根际则是pH和脲酶。     

家蚕CRISPR/Cpf1基因编辑系统建立

自CRISPR/Cas9基因编辑系统成功应用于模式生物以来,因其快速、高效、便捷等特点,广泛应用于基因功能研究、基因治疗和基因工程等研究领域。与此同时,CRISPR/Cas系统不断在微生物界的发现也加速了新的基因编辑工具的不断涌现。CRISPR/Cpf1是第二类 (Ⅴ型) 能够编辑哺乳动物基因组的CRISPR系统,相比于CRISPR/Cas9基因编辑系统,能够利用5′T-PAM富集区增加基因组覆盖率,具有其切割位点为粘性末端和更不易同源重组修复等诸多优势。基于此,本研究构建了能够在家蚕细胞表达的3个不同来源的CRISPR/Cpf1 (AsCpf1、FnCpf1和LbCpf1) 表达载体,选择高度保守的家蚕热休克蛋白基因BmHSP60和家蚕ATP酶家族BmATAD3A基因分别设计靶标gRNA,构建gHSP60-266R和gATAD3A-346R基因编辑载体。通过T7E1酶切分析和T克隆测序,鉴定3个Cpf1基因编辑系统AsCpf1、FnCpf1和LbCpf1对靶标基因BmHSP60和BmATAD3A的编辑效率。同时,利用Western blotting分析不同基因编辑系统敲除靶基因后对其BmATAD3A和BmHSP60蛋白翻译的影响。本研究成功构建了家蚕CRISPR/Cpf1基因编辑系统,能够在家蚕细胞中有效编辑家蚕基因组,为家蚕基因功能研究、基因工程和遗传育种开发了新技术与新方法。     

中欧组织间合作研究项目MIX-UP助力实现“碳中和”

随着全球塑料循环体系的变革升级,提高塑料的回收利用不仅可以减少塑料在生命周期中的碳排放,还可以解决废塑料潜在的生态环境危害。文中介绍了2019年国家自然科学基金组织间国际 (地区) 合作研究项目“废塑料资源高效生物降解转化的关键科学问题与技术 (MIXed plastics biodegradation and UPcycling using microbial communities,MIX-UP)”。该项目聚焦“塑料污染”这一全球化的问题,围绕中欧双方确定的“塑料生物降解菌群”研究领域,联合中欧双方14家优势科研单位,开展实质性的重大前沿合作研究。针对废塑料生物降解中存在的解聚与重塑两个难题,项目以难降解石油基塑料 (PP、PE、PUR、PET和PS) 以及生物可降解塑料 (PLA和PHA) 的混合废塑料作为研究对象,从塑料微生物降解途径解析及关键元件的挖掘与改造、塑料高效降解混菌/多酶体系的构建与功能调控、塑料降解物的高值化炼制途径设计与利用策略3个方面展开研究。本项目将突破废塑料生物降解转化中高效降解元件挖掘、塑料降解物高值化利用的关键科学问题与技术,探索一条废塑料资源化、高值化、循环化、低碳化的新塑料循环路线,建立以“降塑再造”为核心理念的废塑料生物炼制体系,丰富我国固废资源化生物技术利用平台。项目的实施不仅有助于提升我国塑料 (生物) 循环经济的理论基础和关键技术水平,还可以推动我国与国际科研院所的多边交流与合作,促进我国在生物技术领域的创新发展,助力我国碳中和目标的实现。     

一种来源于红螺菌科细菌新型卤醇脱卤酶的克隆表达及其酶学性质鉴定

作为一类多功能生物催化剂,卤醇脱卤酶在手性β-取代醇和环氧化合物合成应用方面备受关注。目前催化功能较为清楚的卤醇脱卤酶不足40种,且绝大部分催化性能并不能满足科学研究和实际应用的要求,因此挖掘并鉴定更多的卤醇脱卤酶具有重要意义。本文克隆表达了来源于红螺菌科细菌Rhodospirillaceaebacterium中一个假定卤醇脱卤酶(HHDH-Ra)并对其催化特性以及酶学性质进行研究。将HHDH-Ra基因克隆到表达宿主大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3),结果显示目的蛋白为可溶性表达。底物特异性研究显示HHDH-Ra对1,3-二氯-2-丙醇(1,3-DCP)和4-氯-3-羟基丁酸乙酯(CHBE)具有良好的特异性。以1,3-DCP为反应底物获得HHDH-Ra的最适pH和最适温度分别为8.0和30℃。pH稳定性结果显示HHDH-Ra在pH 6.0–8.0具有较好的稳定性且经过100 h处理以后仍能保持70%左右的酶活。温度稳定性结果显示HHDH-Ra在30℃、40℃条件下的半衰期为60h,且当温度提高到50℃时,该酶的半衰期仍有20h,远高于已报道的酶。因此,来源于Rhodospirillaceae bacterium新型卤醇脱卤酶具有较好的温度、pH稳定性以及催化活性,在合成关键化学、医药中间体中具有一定的应用潜力。     

CRISPR/Cas9系统在疾病研究和治疗中的应用

基因组编辑技术(Genomeeditingtechnology)是一种通过人工手段在基因组水平对DNA序列进行改造的遗传操作技术,包括特定DNA片段的插入、敲除、替换和点突变。其中,依赖核酸酶的基因组编辑技术的基本原理是在基因组的特定位置产生双链DNA断裂(Double-strandedbreak,DSB)后通过非同源末端连接(Non-homologous end joining,NHEJ)或同源重组(Homologous recombination,HR)的方式进行修复。随着对核酸酶更深入的研究,基因组编辑技术也得到了快速发展,其中最常使用的核酸酶主要包括巨型核酸酶、锌指核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶以及成簇的规律间隔的短回文重复序列相关蛋白(Clusteredregularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated proteins (Cas)。文中在介绍上述基因组编辑技术的发展及作用原理的基础上,主要综述了CRISPR/Cas9系统在基因功能鉴定、疾病模型建立、基因治疗和免疫治疗等应用领域的研究进展,并对其未来发展进行了展望。     

斑马鱼和鲤miR-1-2/133a-1基因间序列活性和调控研究

分别以斑马鱼(Danio rerio)和鲤(Cyprinus carpio L.)为研究材料, 通过克隆斑马鱼和鲤miR-1-2和133a-1的基因间增强子序列, 利用活体和离体实验探讨其是否具有肌肉特异性; 并通过荧光素酶报告系统等研究转录因子MyoD是否调控该序列。研究结果显示: 在活体实验中, 无论斑马鱼还是鲤, miR-1-2/133a-1基因间序列均有肌肉特异性, 且保留有保守区域(cr, 含有E-box)的序列, 注射72h后GFP表达量明显高于其他突变体。体外细胞实验也显示, 转染含有cr序列的实验组, 分化后的荧光素酶活性明显高于分化前。进一步探讨MyoD对miR-1-2/133a-1基因间序列的调控作用结果显示: 无论是斑马鱼还是鲤, miR-1-2/133a-1基因间序列活性均受MyoD调控。结果为完善鱼类肌肉发育机理, 及未来的鱼类分子育种奠定基础。     

2-羟基-3-甲基蒽醌抑制结直肠癌的作用及机制研究

为观察2-羟基-3-甲基蒽醌(HMA)对结直肠癌细胞增殖的影响并探讨其作用机制,本研究采用CCK8法检测HMA对结直肠癌细胞增殖的影响;Heochst-33343/PI染色检测细胞凋亡情况;同时检测细胞内ROS及GSH含量变化并应用Western blot检测细胞凋亡相关蛋白及Keap-1/Nrf-2/ARE信号途径相关蛋白的表达。实验结果显示,HMA给予结直肠癌细胞后,细胞内ROS含量升高,GSH含量减少;HMA通过抑制Keap-1/Nrf-2/HO-1通路,诱导细胞发生凋亡。综上表明HMA具有抑制结肠癌细胞增殖的作用,其机制可能与破坏细胞内氧化还原平衡,抑制Keap-1/Nrf-2/HO-1通路有关。     

三级串联垂直潜流人工湿地的脱氮性能及微生物学特征

探究了3种水力负荷(HLR)下三级串联垂直潜流人工湿地(T-VFCWs)对农村生活污水的处理效果,并解析了系统中的氮素转化机制。结果表明: 当系统HLR由0.10增至0.20 m³·m^-2·d^-1时,T-VFCWs始终保持着对农村生活污水高效的处理效果,系统出水水质满足《城镇污水处理厂污染物排放标准》(GB 18918—2002)一级A标准。T-VFCWs中顺次连接的3个VFCW单元(标记为V-1、V-2和V-3)在限氧环境下因其进水水质的差异可形成各自不同的氮素转化途径,并通过协同作用实现系统的高效脱氮。当T-VFCWs在试验期间连续运行时,V-1、V-2和V-3中主要的脱氮途径分别为短程硝化/反硝化作用、基于亚硝化的全程自养脱氮(CANON)作用和反硝化作用,上述3单元对进水中总氮(TN)和NH₄⁺-N去除的贡献率分别为(51.3±4.4)%和(63.7±2.6)%、(30.9±4.8)%和(35.5±4.5)%、(17.8±5.0)%和(0.8±0.1)%。该研究可为组合式人工湿地的研发及工程化应用提供科学依据和技术支撑。