表皮生长因子受体干扰序列与白细胞介素24融合蛋白的原核表达

目的：在大肠杆菌中表达表皮生长因子受体干扰序列（EGFRi）与白细胞介素24（IL-24）的融合蛋白。方法：人工合成肿瘤细胞表面受体特异性结合位点EGFRi核苷酸序列,应用重叠延伸PCR技术将其与IL-24基因连接,其间引入一段柔软短肽编码基因;将融合基因克隆入pET-22b原核表达载体,IPTG诱导融合蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）中表达,对表达条件进行优化;用His·Bind纯化试剂盒对表达产物进行纯化,SDS-PAGE进行鉴定。结果：酶切和测序结果证实EGFRi-IL-24融合基因的原核表达载体构建正确;在IPTG浓度为0.8mol／L、28℃诱导10h的条件下,可溶性融合蛋白表达量最高;表达产物的相对分子质量与预期值一致,为22000;经纯化得到了均一的融合蛋白。结论：获得大肠杆菌表达的融合蛋白EGFRi-IL-2,可用于活性分析。     

吸附-交联法固定D-泛解酸内酯水解酶的研究

选择6种吸附树脂和离子交换树脂对D-泛解酸内酯水解酶进行固定化,筛选出了固定化效果较好的大孔弱碱性丙烯酸系阴离子交换树脂D-380为载体,用先吸附后交联的方法固定化。通过实验对固定化条件进行了优化,得出最佳的固定化条件为：加酶量6U／g树脂、吸附pH7．5、吸附时间4h、吸附温度30℃、交联剂戊二醛终浓度0．1％、交联时间2h。实验表明在此条件下制得的固定化酶有很好的稳定性：固定化酶在连续20次的底物水解反应后,剩余酶活达到71％。当温度达到80℃时游离酶几乎失去酶活,而固定化酶剩余酶活为60％以上。游离酶的pH稳定性范围为pH7～8,而固定化酶为pH6．5～8．5。     

里氏木霉306产t-PA固态发酵条件的研究

对基因工程菌株里氏木霉(Trichodermareesei)306生物合成组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)的固态发酵培养基成分和发酵条件进行了研究;分析了发酵过程中t-PA的生成、总糖的消耗和菌体生长的规律。在优化的固体发酵条件下,t-PA的最大酶活是924.63IU/g干重培养基,较初始条件下提高了5倍。通过浅盘进行了放大实验,最大酶活为983.64IU/g干重培养基,t-PA合成速率为:13.66IU/g干重培养基.h,较三角瓶固态发酵最高产酶提高了6.38%,产酶速率提高了24.07%。     

杂色云芝漆酶基因(Lcc1)的克隆及在甲醇毕赤酵母中的表达

以白腐菌杂色云芝Coriolus versicolor RNA为模板,通过RT-PCR获得漆酶Leel基因的cDNA片段。构建了甲醇酵母表达质粒pMETA-Lccl载体,并将其线性化后用电穿孔法导入Pichia methabolica PMAD16,部分阳性克隆的PCR结果表明Lccl基因已经整合到甲醇毕赤酵母染色体上,经摇瓶培养筛选出表达水平较高的酵母工程菌株。漆酶酶活力达53U/L     

高温和H2O2诱导酵母细胞产生活性衍生物的研究

对高温和H2O2应激条件下产生活性酵母细胞衍生物(Live Yeast Cell Derivative,简称LYCD)进行了研究。结果表明：低剂量的预处理(37℃和0．2mmol／LH2O2)能够增加细胞内谷胱甘肽(GSH)含量,提高超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性。两种预处理均可以诱导对致死浓度H2O2的抗性。通过37℃和0．2mmol／LH2O2处理酵母细胞后,提取LYCD并添加到酵母细胞培养液中,发现细胞在致死浓度H2O2作用下的存活率明显提高,说明温度和H2O2刺激酵母细胞形成的LYCD对细胞氧化具有抵抗作用。     

基因工程菌里氏木霉染色体DNA的提取方法

研究基因工程菌株里氏木霉(Trichoderma Teesei)染包体DNA的提取方法。采用冷冻研磨CTAB法、氯化苄SDS法和冷冻研磨SDS法三种提取DNA的力法。通过琼脂糖凝胶电泳埘提取的DNA进行检测。结果表明：冷冻研磨CTAB法更适合此类DNA的提取。对冷冻研磨CTAB法提取条件进行了优化。用该法提取的DNA上的外源基因t—PAcDNA部分片段进行PCR扩增,获得良好结果。用本实验冷冻研磨CTAB法提取的DNA完全适用于PCR和其它的分子生物学操作的要求。     

白腐菌产锰过氧化物酶培养基的优化

黄孢原毛平革菌(Phanerochaete Chrysosporium)5．776在初始发酵培养基中产胞外锰过氧化物酶活力极低。为了显著提高锰过氧化物酶活力,对初始发酵培养基进行优化。通过调整培养基中碳源、氮源种类和含量,吐温80添加量,Mn^2 终浓度,静置培养温度、时间,采用分光光度计法测定酶活力,发现黄孢原毛平革菌在限氮高锰培养基中产生较高的锰过氧化物酶。静置液体培养的优化条件是：葡萄糖10g／L;酒石酸铵2mmol／L;吐温80 lg／L;Mn^2 9．9μg／L;于34℃静置培养5d;产MnP活力达1200U／L,比优化前提高了近17倍。     

枯草芽孢杆菌葡萄糖脱氢酶基因的克隆及其序列分析

根据Lampel报道的葡萄糖脱氢酶基因序列设计合成两条引物,以野生型枯草芽孢杆菌染色体DNA为模板,PCR扩增得到含有葡萄糖脱氢酶基因的大约780bp的DNA片段,将其克隆到pUC-T载体中。序列分析表明,克隆得到的葡萄糖脱氢酶基因含有783bp,编码261个氨基酸的蛋白质。得到的基因序列与文献报道的进行比较,其核苷酸同源率为75．5％,编码氨基酸序列的同源率为83．9％。     

补料分批法高密度培养凝结芽孢杆菌

研究在摇瓶条件下通过补加含有不同浓度的葡萄糖与酵母膏的料液及不同流加方式对凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)TQ33菌体量和芽孢生成量的影响,确定了补料液中的葡萄糖与酵母膏比例为61(w/w),采用将葡萄糖浓度控制在3.0g/L～6.0g/L的流加方式进行高密度培养凝结芽孢杆菌.在5L自动发酵罐中进行补料分批培养,最终菌体浓度达到4.5×109cfu/mL,芽孢浓度为1.2×109cfu/mL,分别是分批培养的5.9倍和3.8倍.     

枯草芽孢杆菌ZC-7中性蛋白酶的分离纯化及酶学性质研究

枯草芽孢杆菌ZC-7的发酵液,经离心分离得到粗酶液,再经硫酸铵盐析、中空纤维膜除盐浓缩、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析、Sephadex G-75柱层析等步骤获得电泳纯的中性蛋白酶。SDS-PAGE测得其分子量大约为42KDa。以酪蛋白为底物时,该酶的Km为5×10-3,Vmax为2.5×104ug/min,酶的最适作用pH为7.0,最适反应温度为55℃,在pH6.5～8.0, 40℃以下较稳定,对1mol/L H2O2具有一定的耐受性。EDTA、异丙醇和乙醇对该酶有抑制作用,Ca2+、Mg2+和Li+离子对其具有保护作用。