甜菜碱增强长片段PCR的扩增

聚合酶链式反应 (PCR)作为一项非常成熟的技术可以用于基因组序列的扩增。普通的PCR技术只适合于短片段DNA的扩增 ,一般在 6kb以下。对于 6kb至十几kb甚至几十kb以上的DNA片段的扩增就非常困难。通过添加不同化学物质 ,发现甜菜碱对长片段PCR的扩增有非常有效的增强作用。通过对玉米总DNA以及质粒DNA的扩增 ,发现 1mol L到 25mol L甜菜碱对改进PCR扩增效果明显。通过添加甜菜碱 ,可以从玉米基因组中扩增出 9kb以上的单拷贝片段 ,从质粒中扩增出 16kb以上片段。经过试验 ,发现不同GC含量的引物需要使用不同浓度的甜菜碱。甜菜碱可以减少甚至消除长片段PCR中的非特异性扩增。同时 ,我们发现其它的添加物 ,如DMSO ,甘油 ,甲酰胺对长片段PCR的作用不明显     

滇龙胆GrSLS1基因的克隆与原核表达

以滇龙胆转录组为基础,采用RT-PCR技术克隆了滇龙胆幼叶裂环番木鳖苷合酶基因,命名为GrSLS1(GenBank登录号KF941191)。序列分析结果显示,GrSLS1基因开放阅读框长1 560bp,编码519个氨基酸;GrSLS1蛋白相对分子量为59.33kD,pI为8.96。生物信息学分析结果表明,GrSLS1蛋白属于SLS家族成员,其N端含有一跨膜螺旋区域(10~32);二级结构分析结果表明,GrSLS1蛋白主要由α-螺旋和无规则卷曲组成;系统发育分析表明,GrSLS1与帽柱木MsSLS2蛋白亲缘关系最近。构建原核表达载体pGEX-4T-GrSLS1,对GrSLS1基因进行原核表达,SDS-PAGE结果表明所表达蛋白与预期蛋白大小一致。该研究为进一步研究GrSLS1基因功能及通过在龙胆中过表达该基因提高龙胆苦苷含量奠定基础。     

雌激素处理的hBMSC对高糖诱导血管内皮细胞损伤的保护作用*

目的: 探讨雌激素处理人骨髓间充质干细胞(hBMSC)对高糖诱导的人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)损伤的保护作用及机制。方法: 采用30 mmol/L葡萄糖刺激hBMSC细胞建立高糖模型并分组:以无刺激者为高糖对照组(HG组)、以20 μmol/L雌激素处理者为高糖雌激素组(HG+E2组)、以5 μmo/L蛋白激酶B(PKB/Akt)抑制剂Triciribine预处理45 min后,再以20 μmol/L雌激素处理者为高糖Akt抑制剂组(HG+E2+Triciribine组)和正常条件培养的hBMSC为正常对照组(NG组)。分别于处理12 h后,采用CCK8法检测各组hBMSC的细胞活力,硝酸还原酶法和ELISA法检测各组培养基上清中NO、VEGF和IL-8的含量(n=6),48 h后采用Western blot检测内皮型一氧化氮合酶(eNOS)和磷酸化eNOS(p-eNOS)蛋白表达水平(n=3)。此外,提取各组hBMSC的培养基上清作为条件培养基(CM)培养人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)并分组为:HG-CM组(HG组条件培养基处理)、HG+E2-CM组(HG+E2组条件培养液处理)、HG+E2+Triciribine-CM组(HG+E2+Triciribine组条件培养基处理)和HG-H组(高糖对照组,30 mmol/L葡萄糖终浓度处理),分别于12 h后,采用CCK8法检测各组HUVEC的细胞活力(n=6),24 h后采用流式细胞术检测各组HUVEC细胞的凋亡率(n=3);48 h后采用划痕实验观察各组HUVEC细胞的迁移率(n=3)。结果: 与NG组相比,HG组中hBMSC细胞活力和细胞内eNOS蛋白磷酸化水平降低(P<0.05),细胞培养液上清中NO、VEGF和IL-8含量减少(P<0.05);与HG组相比,HG+E2组中hBMSC的细胞活力和细胞中eNOS蛋白磷酸化水平显著增加(P<0.05),细胞培养基上清中NO、VEGF和IL-8含量增加(P<0.05),而当hBMSC细胞中Akt蛋白活性被抑制后,HG+E2+Triciribine组中上述结果指标呈反向变化(P<0.05)。此外,与HG-CM组相比,HG+E2-CM组中HUVECs的细胞活力和迁移能力显著增加(P<0.05),细胞凋亡比例降低(P<0.05),而与HG+E2-CM组相比,HG+E2+Triciribine-CM组中HUVECs的细胞活力和迁移能力降低(P<0.05),细胞凋亡比例增加(P< 0.05)。结论: 雌激素可能通过激活hBMSC细胞Akt/eNOS信号通路,促进NO、VEGF和IL-8的分泌,进而增加HUVECs的细胞活力和迁移能力,并抑制细胞凋亡的发生,对高糖诱导的HUVECs细胞损伤发挥保护作用。     

乙型肝炎病毒X蛋白与端粒酶的关系

端粒（telomere）是真核细胞染色体末端的重复序列,对维持染色体的稳定性具有重要作用 .端粒酶（telomerase）是维持端粒长度必需的一种逆转录酶,在细胞增殖、衰老、永生化 和癌变等方面具有重要的作用.在肿瘤细胞中端粒酶发生明显变化,有较高水平的表达和很 强的活性,成为肿瘤细胞的重要特征之一.乙型肝炎病毒（hepatitis B virus）X蛋白（HBx ）与肝癌的发生密切相关,HBx可以通过多种途径发挥致癌作用,其中一个重要的分子机制 ,即激活人端粒酶反转录酶hTERT（为端粒酶的催化亚单位）使细胞发生永生化而癌变.因此 ,详细阐明HBx与hTERT的关系对于揭示乙肝病毒致癌机制具有重要的意义.本文对HBV的分子 结构和HBx的分子生物学特性进行了详细的阐述,对HBx与hTERT及其调控因子的关系进行了 归纳和总结,有助于进一步阐明HBx的致癌机制.     

花生四烯酸诱导肌球蛋白磷酸化被抑制的平滑肌细胞 迁移的信号传导途径

在应用肌球蛋白轻链激酶特异抑制剂ML-7抑制了肌球蛋白轻链磷酸化后,花生四烯酸(arachidonic acid,AA)仍可诱导兔血管平滑肌细胞（SM3）发生迁移.为了进一步阐明其信号传导途径,应用多种信号抑制剂,采用免疫印迹、Boyden小室和提取细胞膜蛋白等实验方法,对上述迁移作用的信号传导途径进行了深入的研究.结果显示,PTX（Gi蛋白抑制剂）、U73122（PLC抑制剂）、staurosporine (PKC抑制剂)、PD98059（ERK1/2抑制剂）和SB203580（p38抑制剂）分别可拮抗上述AA诱导的SM3细胞迁移作用,而SP600125（JNK抑制剂）的作用较弱.免疫印迹结果显示,AA可提高SM3细胞中PKC(ε)、ERK1/2、p38和JNK信号的磷酸化水平,呈时间依赖性, PTX或U73122可抑制上述作用;staurosporine可抑制由AA 引起的ERK1/2和JNK的磷酸化水平增强,但对p38的磷酸化水平无影响.还发现AA可促进PLCβ2的细胞膜移位, PTX可抑制其作用.上述结果表明,当肌球蛋白轻链的磷酸化被抑制后, AA可通过Gi蛋白的活化促进PLCβ2向细胞膜移位,进而通过激活PKC(ε)、ERK1/2、p38和JNK等信号转导途径而诱导SM3细胞发生迁移     

环境生物技术信息学及其应用

通过介绍环境生物技术及生物信息学的产生发展及应用,概述了环境生物技术信息学的内容与应用前景。     

小鼠皮肤损伤修复过程中白细胞介素-6对某些炎症因子基因表达的影响

为了解在皮肤损伤修复过程中白细胞介素-6(Interlukin-6,IL-6)对其他炎症因子基因表达的影响,以及对皮肤损伤修复过程的影响,用免疫组织化学染色法和RT—PCR法,检查了IL-6基因敲除鼠(IL-6^-/-鼠)和正常野生型鼠(IL-6^ / 鼠)皮肤损伤后损伤区组织内不同时间的白细胞介素-1α(Interlukin-1α,IL-1α)、白细胞介素-1β(Interlukin-1β,IL-1β)、角质细胞诱导因子(Keratinocyte chemoattractant,KC)、单核细胞诱导蛋白-1α(Macrophage inflammatory protein-1α,MIP-1α)以及单核细胞诱导蛋白-2(Macrophage inflammatory protein-2,MIP-2)这5种炎症因子的基因表达的变化。结果发现：不论是IL-6^-/-鼠还是IL-6^ / 鼠,其被检因子的基因表达都以第3d为高峰,第6d则明显下降;同时,在损伤后的第3d和第6d,IL-6^-/-鼠的5种因子的基因表达水平显著低于IL-6^ / 鼠,而在损伤后的第1d,只有MIP-1α和KC的水平低于IL-6^ / 鼠,而且,IL-6^-/-鼠的皮肤损伤修复过程也稍迟于IL-6^ / 鼠,但皮肤的损伤仍可完全修复。上述结果显示,IL-6在小鼠皮肤损伤过程中诱导其他5种被检因子的产生,从而促进皮肤损伤的修复,但IL-6基因缺失也不会严重影响皮肤损伤的修复。     

乙肝病毒X蛋白突变体(HBxΔ127)通过ERK上调钙蛋白酶小亚基1促进肝癌细胞迁移

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV) X蛋白(HBx)对肝癌的发生发展具有十分重要的作用.我们前期研究发现,HBx 突变体(HBxΔ127)与肝癌的增殖和迁移有密切的关系. 钙蛋白酶小亚基1（calpain small subunit 1,Capn4）具有促进细胞迁移、增殖和分化的作用.本研究对HBx 突变体(HBxΔ127) 促进肝癌细胞迁移的分子机制进行了研究. 实验结果显示, HBxΔ127可明显激活Capn4的启动子活性和上调Capn4蛋白表达.应用ERK抑制剂PD98059作用肝癌细胞后,可明显抑制HBxΔ127对Capn4的上调作用,提示HBxΔ127可通过磷酸化ERK1/2 (p-ERK1/2)上调Capn4应用伤口愈合实验进一步证实,HBxΔ127促进肝癌细胞迁移的作用与Capn4 和p-ERK1/2有关.本研究结果表明, HBxΔ127促进肝癌细胞迁移的作用是通过p-ERK1/2上调Capn4实现的. 这一发现对进一步揭示HBx 突变体HBxΔ127促进肝癌细胞转移的分子机制具有重要意义.     

面向血液葡萄糖测量的生物组织阻抗模型

本文推导了细胞膜电容与血糖浓度之间的关系,并将这种关系应用到Pauly和Schwan提出的弛豫模型中,再将弛豫模型应用于多重Cole-Cole介电模型,最后通过介电模型得出阻抗模型,建立起人体血糖浓度与组织介电谱,阻抗谱之间的联系。通过分析发现,细胞膜电容随着血糖浓度增加而增大,且当血糖浓度趋于无穷大时,细胞膜电容等于血糖浓度为0时细胞膜电容的1.53倍。对介电谱的仿真得出,当外加信号频率小于1 MHz时,介电常数实部随着葡萄糖浓度改变而发生明显变化。阻抗谱的研究结果表明,随着葡萄糖浓度的升高,阻抗的实部减小,阻抗虚部模增大,且分别在频率为1.48 MHz和0.55 MHz时变化得最快。本文建立的模型为血糖无创检测提供了一种新的方法和手段。     

玉米淀粉分支酶基因的克隆与RNAi表达载体的构建

利用网络数据库http://jura.wi.mit.edu/bioc/siRNAext/,确定玉米淀粉分支酶SBEⅡb的部分基因序列作为RNAi的目标序列,通过RT-PCR方法从玉米自交系‘综31’中分别成功克隆出了玉米淀粉分支酶sbeⅡb基因的部分序列及其启动子序列,从大肠杆菌中成功克隆了木糖异构酶基因xylA作为筛选标记,构建了含有35S驱动的木糖异构酶基因和sbeⅡb启动子驱动的含有sbeⅡb目标序列的反向重复序列的表达载体pBAC413,并对玉米自交系实施转化。经PCR检测转基因玉米再生植株,初步判定目的序列已经成功整合到玉米再生植株的基因组中。