面包酵母催化不对称合成4-氯-(R)-3-羟基丁酸乙酯

以4 氯乙酰乙酸乙酯为原料,以面包酵母为手性生物催化剂,选择性合成光学活性4 氯 (R) 3 羟基丁酸乙酯。经IR、GC MS、1HNMR和旋光度测定,表明所得产品的结构与预期的结构一致。分别考察了面包酵母用量、葡萄糖浓度、底物投入量、pH值、反应时间以及反应温度等因素对产品比旋光度的影响。结果表明,4 氯乙酰乙酸乙酯不对称生物还原反应的适宜条件为:面包酵母6 0 0g/L、葡萄糖2 0g/L、反应温度34℃、底物加量16mL/L、反应时间4 8h、pH为5 ,产品的比旋光度为[α]2 0D = 13 9°。     

利用柑橘皮固体发酵生产复合酶菌株的选育

本试验对14个菌株以柑橘皮为主要原料固体发酵生产复合酶的生产性能进行了比较, 发现宇佐美曲霉Aspergillus usaanii具有较好的复合酶产率,为进一步提高该菌株的产酶能力, 我们利用γ-射线辐射对其进行了诱变育种,选育得到一株纤维素酶活提高26%、酸性蛋白酶提高28%、木聚糖酶提高24.5%的突变菌株AU—C33。采用正交试验方法对该菌株的基础培养基进行了优化,结果表明豆粕和尿素含量对各酶活具有极显著影响。以柑橘粉计,当添加23% 豆粕、8%麸皮、3%尿素,水分含量在60%,28℃培养60h后,CMCase、FPA、β-葡萄糖苷酶、酸性蛋白酶和木聚糖酶分别达到了20.8U/g、7.25U/g、74.7U/g、7248.4U/g和3222.6U/g。     

中国人卵巢上皮性肿瘤nm23H1基因遗传不稳定性的研究

采用石蜡包埋组织抽提DNA,PCR-单链构象多态性(PCR-SSCP),常规银染、Envision免疫组织化学染色和Leica-Qwin计算机图像分析等方法,研究人类17号染色体D17S396位点微卫星不稳定(microsatellite instablility,MSI)和杂合性缺失(loss of heterozygosity,LOH),对卵巢上皮性肿瘤nm23H1蛋白表达的影响,阐明nm23H1基因遗传不稳定性与卵巢肿瘤进展的关系,为揭示nm23H1基因作用机制和肿瘤转移机制提供实验依据。本实验中,卵巢上皮性癌D17S396位点遗传不稳定发生率为40%,明显高于交界性肿瘤的9.52%,而在良性肿瘤和正常卵巢组织中,未见该位点遗传不稳定的发生。其中,LOH的发生率,随肿瘤恶性程度的增高而增加(P<0.05)。在卵巢上皮性癌中,淋巴转移组的LOH发生率高于无淋巴转移组(P<0.01)。FIGO Ⅲ Ⅳ期的LOH发生率高于Ⅰ Ⅱ期(P<0.05)。MSI发生率与卵巢上皮癌组织类型、分化程度、淋巴转移及FIGO分期均无关。nm23H1 蛋白阳性率在卵巢上皮性癌和交界性肿瘤组织中分别为56.00%和57.14%,高于良性肿瘤的13.64%和正常卵巢组织的8.33%(P<0.01)。卵巢上皮性癌中,淋巴转移组nm23H1蛋白阳性率低于无淋巴转移组;FIGO Ⅲ Ⅳ期nm23H1蛋白阳性率低于Ⅰ Ⅱ期(P<0.05)。此外,计算机图像定量分析显示,在各临床病理参数影响下,nm23H1蛋白的表达强度没有差异。在卵巢上皮性癌中,LOH阳性组中nm23H1蛋白阳性率为0.00%,显著低于LOH阴性组的73.68%(P<0.01)。实验结果提示, nm23H1基因的遗传不稳定性可能是卵巢上皮性癌发生、发展的一个重要机制。LOH的发生可作为卵巢组织恶变的判断指标。nm23H1基因的MSI和LOH,通过相互独立的途径调控卵巢上皮癌的发生和转移,后者可抑制卵巢上皮癌局部nm23H1蛋白的表达,并赋予卵巢上皮癌高淋巴结转移、低预后的特性。提高卵巢上皮癌局部nm23H1蛋白的表达,可减缓肿瘤的淋巴转移并提高预后率。     

恶臭假单胞菌NA-1菌株烟酸羟基化酶活性的诱导和转化条件的研究

恶臭假单胞菌NA-1菌株的培养和产酶特性与已报道的产酶菌株粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)IFO12648和荧光假单胞菌(Psudomonasfluorescens)TN5有所不同,主要反映在最适碳源及浓度、最适诱导剂浓度和最适培养温度等方面。最适的转化条件是温度为30℃,pH为7.0,烟酸的浓度为3%。采用初步优化后的条件和流加底物的方式进行4L上罐生产,恶臭假单胞菌NA-1菌株的6-羟基烟酸产率可达到108.39gL。     

重组超耐热酸性α-淀粉酶的分离纯化及其性质研究

基因工程菌所产生的重组超耐热酸性α-淀粉酶,通过超滤浓缩、脱盐和聚丙烯酰胺垂直板凝胶电泳进行纯化,得到电泳纯的超耐热酸性α-淀粉酶,纯化倍数为11.7,活力回收率为29.8%。用SDSPAGE测得该酶的分子量为55kD,酶的等电点pI(室温)为5.0,以可溶性淀粉为底物的Km值为1.12gL,用硫酸酚法测得其含糖量为15.4%。该酶的最适反应温度为95℃,最适反应pH值为4.5。在pH4.0～7.0室温放置48h酶活没有变化,110℃保温1h残留60%活力。Cr3 、Fe2 、Cu2 抑制酶的活性,Ca2 对酶活无影响。EDTA和DTT对酶的活性无影响。     

扣囊复膜孢酵母β-葡萄糖苷酶基因在毕赤酵母中的克隆与表达

利用PCR技术,从扣囊复膜孢酵母的总DNA中扩增得到β-葡萄糖苷酶（β-Glucosidase）基因 (BGL1),长度为2596 bp,连接到pGEMT载体上,用限制性内切酶切下目的基因,插入到巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9K中,使之位于α-因子信号肽下游,且与之同框, 构建成重组质粒pSHL9K。 通过电转化将重组质粒pSHL9K插入到Pichia pastoris GS115菌株染色体中,获得高效表达BGL1基因的毕赤酵母重组工程菌株。重组酶的最适温度为50℃,最适pH为5.4。培养基中β-葡萄糖苷酶活性最高可达47U/mL。     

外源β-胡萝卜素、光照对青霉PT95菌株菌核分化和类胡萝卜素产率的影响

初步研究了外源β-胡萝卜素和光照对青霉PT95菌株菌核分化和类胡萝卜素产率的影响。结果表明,在培养基中加入外源β-胡萝卜素后,PT95菌株渗出液出现的时间、菌核出现的时间延迟了,但菌核成熟的时间没变。培养基中的外源β胡萝卜素浓度越大,其渗出液、菌核出现的时间越迟。外源β胡萝卜素亦能降低PT95菌株的脂质过氧化水平和菌核中的类胡萝卜素含量。高氧胁迫的光照培养条件有利于PT95菌株的菌核分化和色素在菌核中的积累;与低氧胁迫的黑暗培养条件相比,其菌核生物量和类胡萝卜素产率分别增加了18.7%和101%。以上实验结果表明,若想获得高的菌核生物量和类胡萝卜素产率,应该尽可能在高氧胁迫、无抗氧化剂存在的条件下培养PT95菌株。     

小鼠α1，2岩藻糖基转移酶基因的克隆及表达

本文报告小鼠GDP岩藻糖：β半乳糖苷α1,2-岩藻糖基转移酶（α1,2-fucosyltansferase,α1,2-FT）基因的克隆,并进行功能鉴定。利用RT—PCR方法克隆小鼠α1,2-岩藻糖基转移酶基因编码区MFUT-II,测序后将其插入表达载体pcDNA3．1的多克隆位点,构建表达载体pcDNA3．1-MFUT-II;采用磷酸钙法将其转染于COS-7细胞进行表达,通过对底物特异性比较研究酶的性质;应用Northern印迹杂交法研究基因在小鼠组织中的表达情况;应用Southern印迹杂交法分析基因存在状态。结果证实MFUT-II为小鼠α1,2-岩藻糖基转移酶基因家族的新成员。含有一个完整的开放读码框。可编码347个氨基酸。其估计分子质量为39kDa,和小鼠日及Sec1基因具有序列同源性。分别与人类Se基因（79．O％）、大鼠Ratrrs（89％）基因、兔Rabbit FT-III基因（77％）具有较高的序列同源性。用MFUT-II基因转染的COS-7细胞具有α1,2-FT活性。MFUT-II可在多种组织中产生3．5kb大小的mRNA转录产物。基因Southern印迹杂交分析结果显示：基因MFUT-II仅为一个拷贝。这些结果证明MFUT-II为小鼠的Se基因。     

葡萄糖类似物甲基葡萄糖对表皮葡萄球菌生物被膜形成的影响及调节机制的研究

生物被膜(Biofilm)是条件致病菌表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)的主要致病因素,生物被膜的形成依赖多糖PIA的合成,PIA合成与细菌糖代谢相关。通过研究葡萄糖类似物甲基葡萄糖(MethylDglucoside,MG)对生物被膜的形成及相关基因表达的影响,考察生物被膜形成的调控机制并寻找抑制生物被膜形成的方法。甲基葡萄糖能抑制97337株生物被膜的形成,而且不同浓度的甲基葡萄糖对生物膜作用不同。甲基葡萄糖对97337株生物被膜形成的早期的粘附有较强的抑制作用;不同浓度的甲基葡萄糖处理后对ica和AtlE基因的mRNA表达水平影响不大,但能诱导agr基因的表达,这与甲基葡萄糖处理不同时间后的结果一致;而且甲基葡萄糖处理后97337的表面相关蛋白的组成明显改变。甲基葡萄糖对生物膜的抑制并不直接由于它对生长的抑制,它对细菌生长和生物被膜形成的抑制与其在细菌糖代谢中的竞争性相关;甲基葡萄糖能通过调控agr基因的表达改变细菌表面从而抑制97337的早期粘附和生物被膜的形成,但没有通过调控icaADBC、icaR的表达抑制生物膜的形成,可能与其对合成PIA相关糖基转移酶的竞争性抑制相关。     

银鲫种系细胞标记分子Vasa: cDNA克隆及其抗体制备

种系细胞始自胚胎发育早期,是动物生殖及生殖工程的基础。为研究鱼类的种系细胞提供标记分子,我们克隆并鉴定了银鲫的vasacDNA即Cagvasa。CagvasacDNA全长2771碱基(nt),编码的蛋白为银鲫Vasa即CagVasa,全长701个氨基酸(aa)。CagVasa蛋白与已知Vasa蛋白的结构特征一致:在N端有14个RGG重复序列,在C端Vasa所特有的8个功能域俱全。银鲫Vasa与鲤鱼、斑马鱼、陆生脊椎动物和果蝇的Vasa蛋白分别有95%,89%,61%-66%和50%的同源性。卵巢切片的RNA原位杂交揭示,Cagvasa限于种系细胞,且表达水平呈现出低-高-低的动态变化:即两头低(卵原细胞跟Ⅳ期成熟卵子),中间高(Ⅱ-Ⅲ期卵子)。为分析鱼类种系细胞提供手段,我们用310aa的N端序列产生细菌的重组蛋白来免疫大白兔,获得了抗Vasa的多克隆抗体αVasa。Western免疫印迹表明,αVasa特异性地识别一个鱼类性腺的蛋白,该蛋白的分子量为75kD,仅见于银鲫的性腺和卵子。卵巢切片的组织免疫荧光共聚焦显微分析表明,抗体αVasa只对种系细胞染色:卵原细胞着色最深,卵母细胞和早期的卵子都浓染,成熟卵则浅染。类似情况亦见之于精子发生早期阶段的雄性种系细胞。卵巢和精巢的体细胞则不着色。因此,Cagvasa编码的当是Vasa同源蛋白,为银鲫种系细胞的第一个标记分子。我们的研究表明,抗体αVasa染色灵敏度高,特异性好,当是鉴别银鲫及其它鲤科鱼类的种系细胞的有效手段