裂殖酵母SAGA复合物亚基Spt20参与钙调蛋白磷酸酶调节的Cl-胞内平衡

SAGA(Spt-Ada-Gcn5 acetyltransferase)复合物是真核生物中高度保守的蛋白复合体, 参与转录激活、mRNA转运等诸多生物学过程。为了探究SAGA复合物亚基的潜在生物学功能, 文章以裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)SAGA复合物核心结构亚基Spt20为诱饵蛋白进行酵母双杂交筛选, 获得了Ppb1蛋白。Ppb1是真核生物重要信号分子-钙调蛋白磷酸酶的催化亚基。酵母双杂交验证及免疫共沉淀实验均表明Spt20与Ppb1可以在体内发生蛋白相互作用。裂殖酵母ppb1+缺失突变体对高浓度Cl-敏感, 而spt20+缺失突变体则能抵抗高浓度的外源Cl-, 维持细胞的正常生长。荧光共定位分析表明, 当外源Cl-浓度升高时, Ppb1蛋白能够从细胞质迁移入核, 与Spt20蛋白在细胞核内发生共定位。遗传分析显示, spt20+缺失可以抑制ppb1+缺失突变体对Cl-高度敏感的表型, spt20+与ppb1+处于Cl-平衡调节的同一通路, 且spt20+位于ppb1+的下游。上述结果表明, spt20+缺失突变体耐受外源高浓度Cl-, Spt20参与了钙调蛋白磷酸酶调节的Cl-胞内平衡。在高等生物中胞内Cl-浓度异常升高与心肌缺血/再灌注损伤等疾病的发生密切相关。鉴于Spt20在真核生物中高度保守, Spt20可能成为潜在的药物靶点应用于Cl-失衡相关疾病的防治中。     

抗FGF2人鼠嵌合抗体在HEK293T细胞中的表达优化

目的：FGF2是肿瘤血管新生过程中最重要的因子之一,因此通过制备抗FGF2人鼠嵌合抗体中和其发挥作用,以达到抑制肿瘤生长的目的。方法：利用分泌抗FGF2抗体的杂交瘤细胞株IgG9B9和人B淋巴细胞,分别克隆抗体轻链可变区V_L、重链可变区V_H和人重链恒定区C_H基因,从pComb3λ载体中扩增出人λ 链恒定区C_L基因,通过重叠PCR,将V_L,V_H和C_L,C_H片段分别连接形成嵌合抗体的轻链L和重链H,将L/H链以单独构建或串联于同一载体的方式,构建抗FGF2嵌合抗体表达载体,并通过调控元件WPRE优化载体、共转染促生长因子aFGF以及调整表达温度等方式提高嵌合抗体在真核细胞中的表达。结果：成功构建了优化表达载体PLexm-WPRE、PLexm-aFGF;L、H链基因也成功构建,并以L、H或L-F2A-H（2A连接肽将L和H连接起来）的方式分别成功连接到PLexm,PLexm-WPRE载体中。转染细胞上清的ELISA鉴定结果表明,L/H链单独构建要比串联构建的方式具有更高的表达水平,WPRE能有效促进抗体的表达而aFGF并不能促进其表达,与31、37℃相比,33℃时抗体的表达量最高,同时嵌合抗体表现出了很好的结合活性及中和活性,竞争IC50=6.25μg/ml。通过亲和层析获得了高纯度的抗FGF2嵌合抗体。结论：在33℃下,人鼠嵌合抗体基因在WPRE存在下表达量最高,且与抗原FGF2有很好的结合活性及中和活性,为临床应用奠定了基础。     

两种类型人碱性成纤维生长因子的体外稳定性研究

目的:通过野生型bFGF和改构型bFGF蛋白溶液中的聚集过程的比较,初步探讨bFGF在水溶液中发生聚集的机理。方法:在选择合适溶液体系后,采用蛋白溶解度和促有丝分裂活性能力为指标,表征野生型bFGF和突变型bFGF聚合程度,分析共价聚合和非共价聚合所起的作用。结果:在相同的溶液体系中,野生型bFGF的聚集程度高于突变型bFGF。bFGF聚合程度与浓度有依赖性。沉淀结果分析非共价聚合占主要作用。结论:野生型bFGF在溶液中共价聚和和非共价聚合同时发生,两种bFGF聚合过程中非共价聚合占较大比例。突变半胱氨酸可以减少聚合发生。     

不同形态的磷源对球形棕囊藻生长及碱性磷酸酶的影响

研究了不同浓度和形态的无机磷(DIP)和有机磷(DOP)对球形棕囊藻细胞生长、培养基中磷浓度的变化以及碱性磷酸酶活性的变化的影响。在缺磷和大分子DOP(卵磷脂)作为磷源的情况下,碱性磷酸酶活性迅速提高,在第9天达到了最大值,其活性分别为19.11U和18.28U,显然在缺磷胁迫下和大分子DOP的利用过程中碱性磷酸酶起着重要作用。DIP(磷酸二氢钾)和小分子DOP(β-甘油磷酸钠)都容易直接被球形棕囊藻吸收利用,碱性磷酸酶活性变化不明显。     

磷胁迫诱导大豆叶片酸性磷酸酶同工酶的表达

通过田间试验对两种磷处理的274个大豆基因型叶片酸性磷酸酶活性进行筛选,并将其中8个进行营养液栽培试验以研究磷胁迫对其叶片酸性磷酸酶同工酶表达的影响.结果表明,大豆叶片酸性磷酸酶活性存在着明显的基因型差异,不施磷处理提高了大部分(约60%)供试基因型叶片酸性磷酸酶的活性.营养液栽培试验表明,低磷处理普遍提高了所有8个供试大豆基因型叶片酸性磷酸酶的活性.等电聚焦电泳结果表明,供试大豆基因型的老叶和新叶中均有6条酸性磷酸酶的同工酶带.低磷处理显著增加了叶片酸性磷酸酶酶带的活性,但是没有诱导新的酸性磷酸酶酶带产生.研究发现叶片酸性磷酸酶活性可作为反映大豆磷胁迫的酶学指标;磷胁迫诱导大豆叶片酸性磷酸酶活性的增加是由于已有同工酶活性的提高而不是由于特异性酶带的产生.     

一种菊酯类复合剂对黑胸散白蚁体内CarEs和Ca-ATPase活性的影响

以黑胸散白蚁Reticulitermes chinensis Snyder为试验材料,研究了一种白蚁防治复合剂中的主要成分对白蚁体内羧酸酯酶（CarEs）和钙 腺苷三磷酸酶（Ca-ATPase）的影响。结果表明：氯菊酯在终浓度为1.66×10^-4 mol·L^-1以下时,对羧酸酯酶无明显抑制作用;八氯二丙醚和壬基酚聚氧乙烯醚在此浓度下都对羧酸酯酶表现出明显抑制作用,其IC₅₀分别为7.1148×10^-5 mol·L^-1和7.3373×10^-4 mol·L^-1;氯菊酯对Ca-ATPase表现出较强抑制作用,IC₅₀为5.11×10^-7 mol·L^-1。认为Ca-ATPase是黑胸散白蚁体内拟除虫菊酯类杀虫剂作用的主要靶标之一。     

长角血蜱唾液腺中腺苷三磷酸双磷酸酶的纯化及其酶切机制

利用染料亲和层析(Cibacorn Blue柱)和离子交换层析(Macrosphere WCX柱)对长角血蜱Haemaphysalis longicornis唾液腺的腺苷三磷酸双磷酸酶进行纯化,经SDS-PAGE证实其分子量为66 kD。腺苷三磷酸双磷酸酶可以水解ATP和ADP,但对AMP无水解作用,水解ATP和ADP的K_m值均为0.2 μmol/L,V_max值分别为12.5和15.6 μmol/(min·mg)。腺苷三磷酸双磷酸酶水解ATP的中间产物是ADP,最终产物是AMP和正磷酸。表明腺苷三磷酸双磷酸酶水解ATP的位点是5'-核苷酸的γ-磷酸键,水解ADP的位点是5'-核苷酸的β-磷酸键。     

碱性成纤维细胞生长因子在苜蓿中的表达

为了降低bFGF(basic fibroblast growth factor)的生产成本,结合植物生物反应器的优点,就bFGF在转基因苜蓿中的表达进行了探索.将bFGF插入植物表达载体pBⅡ21中,获得了含有bFGF基因的植物表达pBIcbFGF,再将pBIcbFGF利用冻融法转到农杆菌中.利用农杆菌介导法将基因转化保定苜蓿,转基因苜蓿在TM-1培养基+20 mg/L卡那霉素(Kan)+200 mg/L特美汀(Tim)中诱导分化,在生根培养基中生根,获得再生植株.再生植株通过PCR检测、RT-PCR及Western blot证实外源基因已经在苜蓿中成功表达.获得含有目的蛋白的阳性植株.为苜蓿作为植物生物反应器生产bFGF奠定了理论及技术基础.     

Expression,purification and characterization of recombinant protein tyrosine phosphatase from Thermus thermophilus HB27

The low-molecular-weight protein tyrosine phospha- tases （PTPase） exist ubiquitously in prokaryotes and eukaryotes and play important roles in the regulation of physiological activities. We report here the expression, purification and characterization of an active and soluble PTPase from Thermus thermophilus HB27 in Escherichia coli. This PTPase has an optimum pH range of 2.8-4.8 when using p-nitrophenyl phosphate as the substrate. The thermal inactivation results indicate a high thermal stability of this enzyme, with the optimum temperature of 75℃ for activity. It can be activated by Mn^2＋, Mg^2＋, Ca^2＋, Ba^2＋, and Ni^2＋, but inhibited by Zn^2＋, Cu^2＋, Cl^-, and SO^2-. These results suggest that this heat-resistant PTPase may play important roles in vivo in the adaptation of the microorganism to extreme temperatures and specific nutritional conditions.     

海洋细菌Bacillus sp．HN07的分离鉴定及所产碱性纤维素酶性质研究

从渤海海域（121°30′00″E,40°25′00″N）海泥中筛选到一株产碱性纤维素酶的海洋细菌。通过形态观察、生理生化特性及16SrDNA序列分析,鉴定该菌株属于芽孢杆菌属（Bacillus）,命名为Bacillussp．HN07。研究表明：HN07最适生长温度30℃,适宜在pH7．0～8．0、含2．0％～3．0％NaCl的培养条件下生长和产酶,并且具有较好的遗传稳定性。酶学性质初步研究显示,HN07所产碱性纤维素酶最适反应温度为45℃,最适pH为8．0,在碱性条件下具有较好的稳定性,具有潜在的工业应用价值。