胚胎干细胞SM22α-EGFP表达克隆的建立及平滑肌细胞体外发育的动态观察

为探讨血管发育早期血管平滑肌细胞(VSMCs)募集和增殖特点,构建了含有SM22α启动子序列和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)编码序列的质粒,建立了平滑肌特异性蛋白SM22α启动子控制下稳定表达EGFP的胚胎干细胞株(ESCs),以研究VSMCs的发育特点.实验发现,起源于SM22α-EGFPESCs形成的胚胎小体(EBs)在第11天开启SM22α启动子并表达EGFP.此后EGFP阳性细胞持续增加,在第30天达到高峰.VSMCs多起源于EBs中细胞密集处,应用免疫荧光染色及RT-PCR观察到EGFP阳性细胞表达多种平滑肌特异性标志物.在贴壁培养的胚胎小体中VSMCs形态可分为纺锤形及上皮样的多角形,慢速视频显微摄像测得纺锤形细胞迁移速度较上皮形细胞快.以上结果表明,SM22α-EGFPESCs分化形成的EBs可以模拟体内早期胚胎血管形成过程,从形态学上获得VSMCs募集分化的证据.     

不同剂量西洛他唑强化抗血小板对冠脉支架术后血小板高反应性的影响

目的：观察临床应用不同方案强化抗血小板治疗改善冠脉支架术后血小板高反应性的可行性、安全性及有效性。方法：选择2009年3月至2011年2月在沈阳军区总医院、中国医科大学第一附属医院、解放军第463医共入选560例冠脉支架术后血小板高反应性（HPR Highon-treatment Platelet Reactivity）患者,在给予阿司匹林300mg／天,氯吡格雷150mg／天,3天后HPR仍未缓解者,随机分为两组,一组在强化抗血小板治疗即阿司匹林300mg,氯吡格雷150mg的基础上加用小剂量西洛他唑（50mg,2／日）,另一组在标准两联方案即阿司匹林300mg,氯吡格雷75mg的基础上加用西洛他唑100mg,2／日,3天后测定HPR的缓解情况。结果：大剂量氯吡格雷治疗3天后HRP的缓解卒为54-3％（304／560）,接受不同西洛他唑剂量治疗3天后又有58．6％的患者HPR缓解,但是西洛他唑50mg组和100mg组HRP缓解率无差别（59．4％VS57．8％,P=0．80）。两组患者30天随访均无死亡及卒中事件,无主要及次要出血事件。结论：强化抗血小板治疗可改善冠脉支架术后的血小板高反应性且未增加出血风险,但其临床获益还需更长时间的随访结果进一步明确,两种强化抗血小板治疗方案对改善冠脉支架术后HPR的作用相似。     

院前明胶海绵栓塞治疗肾血管损伤的动物研究

目的：探讨在新型综合手术救治方舱中明胶海绵栓塞治疗肾血管损伤的可行性和疗效。方法：在新型综合手术救治方舱中构建3例动物肾腹（背）干动脉损伤模型、3例肾段动脉损伤模型,先用1mm×1mm×1mm明胶海绵颗粒对损伤血管进行栓塞治疗,若未能止血,改用2mm×2mm×2mm颗粒栓塞,观察栓塞后15分钟、1月后的肾动脉造影,栓塞后1月的组织病理表现。结果：3例肾段动脉和1例肾腹干动脉使用1mm×1mm×1mm明胶海绵颗粒一次栓塞成功;1例肾腹干动脉和1例肾背干动脉用1mm×1mm×1mm颗粒栓塞未能完全止血,改用2mm×2mm×2mm颗粒栓塞成功。6例动物术后生命体征平稳,全部存活,一个月后造影复查见栓塞动脉来再通,但其余分支动脉血供得到保留。大体标本观栓塞侧肾明显缩小,来见脓腔和脓性分泌物,病理切片示栓塞后局部肾组织有不同范围缺血性梗死。结论：野战方舱中明胶海绵栓塞治疗出血效果明确,对于一般肾血管损伤定位准确,止血迅速、彻底,有良好的可行性和疗效。     

胚胎干细胞分化形成囊状胚胎小体的形态学变化特征

目的观察胚胎干细胞R1(ESs)体外分化形成囊状胚胎小体(CEBs)及其血管内皮细胞和平滑肌细胞的时相规律和结构特点,探讨其在血管发育生物学研究中的作用和意义。方法体外悬浮培养ESs形成CEBs,采用HE染色观察CEBs的结构特点。用免疫荧光染色鉴定不同培养时间的CEBs中CASPASE-3的表达。加入全反式维甲酸(atRA)及联丁酰基cAMP(DBcAMP)定向诱导ESs分化,其后行平滑肌特异性标志物α-肌动蛋白(SMα-actin)及内皮细胞特异性标志物PECAM-1免疫荧光染色。结果典型的CEBs在第13d左右可以形成。第6d就可见CEBs中心部位出现调亡细胞,坏死腔开始形成,到第13d时中心坏死腔完全形成,凋亡细胞明显增多。将第6d的CEBs接种于培养皿后用atRA及DBcAMP处理,3d后可见SMα-actin染色阳性细胞。而未经处理的CEBs贴壁后,在第10d可见PECAM-1的表达。结论CEBs能够模拟体内血管发生形成的过程,可作为研究血管发育生物学的较好模型。     

自然环境中T-2毒素降解菌的筛选与鉴定

[目的]在自然环境中筛选和鉴定能够降解T-2毒素的菌株.[方法]取对虾养殖池水样、养殖池沉泥样品和对虾混合饲料中分离到的镰孢菌,于GYM产毒培养基中培养14 d后引入自然条件下气载细菌,继续培养至28 d,采用LC-MS/MS检测其中T-2毒素含量.然后结合稀释涂布、平板划线、革兰氏染色、镜检,从镰孢菌产毒培养液中毒素含量明显降低的菌悬液中筛选出T-2毒素降解菌,用16S rRNA分析方法对其进行系统发育分析及菌种鉴定,并验证两菌株的降毒能力与不同基质中二者的联合降毒能力.[结果]以从对虾养殖环境中分离到的5株镰孢菌作为试验菌种,在其产毒培养过程中分离到2株T-2毒素降解菌,16S rRNA鉴定结果分别为弯曲假单胞菌和尼泊尔葡萄球菌,对T-2毒素的降解率分别为90.9％和85.5％,但两者降毒能力并无显著差异(P＞0.05);其联合作用也有较好降毒效果,与两菌株单独作用无显著差异(P＞0.05),不同基质对其联合降毒作用影响不大(P＞0.05).[结论]新的T-2毒素降解菌的发现为进一步探明T-2毒素降解基因和开发T-2毒素生物降解酶提供了研究基础.     

红花愈伤组织诱导、生长及其α-生育酚的产生

通过TLC和HPLC初步分析和鉴定,证明从红花(Carthamus tinctorius)无菌苗的胚根、胚轴及子叶和花蕾中诱导出的愈伤组织均具有合成α-生育酚的能力。其中以胚轴的愈伤组织和悬浮培养细胞的生长速率及α-生育酚的含量较高,分别达到0.35、0.39克干重/升·天和0.62、2.28毫克/100克干重样品。对红花细胞生长较适宜的培养基为MC培养基。培养基中附加10％椰子汁或0.1％酪蛋白氨基酸可使细胞生长显著提高,分别达到0.45和0.41克干重/升·天。     

云南红豆杉细胞的悬浮培养

在云南红豆杉细胞悬浮培养中,适宜的培养基为B5,接种量为0．5～0．8g干重细胞／100ml培养基,2,4－D浓度为1．0mg／L;培养细胞的生长周期约30d;培养基中较高浓度的蔗糖（40g／L）可提高紫杉醇含量;添加的椰子汁（CM）、酪蛋白氨基酸（C）和水解乳蛋白（LH）3种有机添加剂均能提高培养细胞中紫杉醇的含量,但只有CM和CA能促进细胞的生长。于B5培养基中添加不同浓度的NH4NO3对培养细胞无明显影响。     

云南红豆杉细胞的悬浮培养

在云南经豆杉细胞悬浮培养中,适宜的增减基为Ｂ５,接种量为０．５－０．８ｇ干重细胞／１００ｍｌ培养基,２,４－Ｄ浓度为１．０ｍｇ／Ｌ;培养细胞的生长周期约３０ｄ;增减基中较高浓度的蔗糖（４０ｇ／Ｌ）可提高紫杉醇含量;添加的椰子汁（ＣＭ）、酪蛋白氨基酸（ＣＡ）和水解乳蛋白（ＬＨ）３种有机添加剂均能提高培养细胞中紫杉醇的含量,但只有ＣＭ和ＣＡ能促进细胞的生长。于Ｂ５培养基中添国不同浓度的ＮＨ４ＮＯ３对培