组织中少量细胞的微卫星长度精细分析

微卫星是基因组上的特殊短重复序列,微卫星不稳定的程度与一些肿瘤的分型、治疗和预后相关。目前,微卫星长度变化的检测往往是基于大量细胞,检测灵敏度低。本文整合激光显微切割技术,基于多次退火环状循环扩增（multiple annealing and looping-based amplification cycles, MALBAC）的单细胞全基因组放大技术和毛细管电泳长度测量方法,经过关键技术点的改进,建立了一套针对组织中少量细胞的多微卫星位点检测方法。研究结果表明,基于技术改进,HE染色的组织细胞经激光显微切割分选后,可成功用MALBAC技术进行全基因组放大,并在多微卫星位点的检测上,获得了高度的准确性和重复性。利用所建立的方法,发现肠型胃癌早期病变组织-肠上皮化生（intestinal metaplasia, IM）的单个腺体内部出现多种长度变化的微卫星改变,说明该癌前病变组织中DNA错配修复系统已经出现问题。本方法所获得的全基因组放大产物,也可以用于外显子组测序和全基因组测序。另外,该方法适用于任何组织的少量细胞,甚至单细胞的多微卫星位点检测,以及全基因组的研究,为精细研究少量病变细胞的基因组特征以及组织异质性提供了有效的方法。     

一种简单、经济、高效的大量肝细胞培养方法

采用组织“切割分离法”加“胰蛋白酶消化法”两种传统方法的组合,获得细小的肝组织块进行贴壁法培养,待肝细胞长满瓶底(肝细胞为主)即传一代(目的去组织块及其他间质细胞),继续培养可获得高密度、高纯度、高活力的肝实质细胞。本实验方法操作简单、经济、高效,适用于一般实验室进行大规模肝细胞培养的细胞培养方法。     

鼻咽癌组织的显微切割及其 RNA 线性扩增

从微小体积鼻咽癌活检标本中获取纯净癌细胞一直是鼻咽癌分子生物学研究中的难题 . 为了寻找一种能从鼻咽癌活检组织中获得高纯度、高质量 RNA 来完成 cDNA 微阵列 (cDNA Microarray) 实验的简便实用方法,采用 RNAlater 技术保存鼻咽癌活检组织,显微切割技术来获得高纯度鼻咽癌细胞,利用 RNA 线性扩增技术得到 cDNA 微阵列实验所需 RNA. 结果表明：利用 RNAlater 技术可以很好地保持组织 RNA 的稳定,通过优化显微切割和 RNA 线性扩增的条件获得了 cDNA 微阵列实验所需的高纯度、高质量 RNA.     

脱氧核酶抑制近日基因period 1表达的实验研究

研究脱氧核酶对近日钟基因period1(per1)表达的影响, 进而寻找治疗和近日节律有关疾病的基因疗法. 设计合成针对per 1的脱氧核酶DRz164, DRz256, 并构建pcDNA3-per1_164:256体外转录载体, 将转录产物和脱氧核酶混合, 在一定反应条件下进行体外切割反应, 地高辛酶联免疫及酶催化显色法检测脱氧核酶的体外切割效率. 将pcDNA3-per1和DRz164或DRz256在脂质体的介导下转染NIH3T3细胞, 通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、流式细胞术(FCM)检测脱氧核酶对近日基因表达的影响. 于37℃孵育2 h后, DRz164对底物的剪切百分率为63%, DRz256为50.5%. RT-PCR半定量检测per1 mRNA表达水平明显下降, FCM结果显示细胞内Per1蛋白的合成受到抑制. 脱氧核酶DRz164, DRz256体外具有定点切割近日钟基因per1mRNA组分的活性, 使转染细胞per1 mRNA 和Per1蛋白表达下降.     

人甲状旁腺素(1-34)衍生物在大肠杆菌中表达、纯化及其生物学活性

为研究Gly hPTH(1 34)衍生物的生物学活性 ,用重叠PCR方法合成编码hPTH(1 34)的DNA片段 ,克隆到融合表达载体pGEX 2T的缩短型谷胱甘肽转移酶基因GST6 9△的 3′末端 ,构建正确读码框架的融合基因 .在两个基因间引入蛋白质羟胺切割位点序列 ,转入E .coliJM10 9中 ,IPTG诱导表达 .该融合蛋白的表达量占菌体总蛋白的 2 0 %以上 ,主要以包涵体形式存在 ,盐酸羟胺切割表达产物 .分析表明 ,80 %左右的融合蛋白被裂解为GST6 9△和Gly hPTH(1 34) .经分子筛柱层析和反相层析分离纯化获得重组Gly hPTH(1 34)衍生物 ,纯度达 98%以上 ,回收率约为 10mg/升发酵液 ,分子量为 4 177,等电点 (pI)为 8 4 0 ,N端 16个氨基酸 ,除第一个为甘氨酸外 ,其余与天然hPTH(1 34)序列一致 .Western印迹结果表明 ,Gly hPTH(1 34)衍生物具有hPTH(1 34)的免疫学活性 .体外活性测定结果表明 ,Gly hPTH(1 34)衍生物能刺激人成骨细胞HOSTE85增殖、增加细胞内胶原合成、ALP活性增高和cAMP生成量增加 ,并呈量效关系 ,提示它具有与化学合成的hPTH(1 34)相同的生物学活性 ,N端多一个Gly对其活性无明显影响 .     

Mg2+和Na+对多核酶系统体外切割反应的影响

为了进一步了解2价Mg^2＋和1价Na+存在与否的情况下,多核酶系统对底物RNA的切割效率,构建了pGEM Coat′A,pGEM Coat′A196Rz 质粒和pGEM MDR1靶质粒．通过用SP6/T7转录试剂盒在体外转录RNA, 在无细胞系统进行切割反应,反应产物通过6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,干胶、X光片曝光自显影,利用Image J 生物图像分析软件分析. 结果表明,多核酶系统的切割效率依赖于二价Mg^2＋的浓度,切割产物随Mg^2＋浓度的增加而增加,而且具有反应时间的依赖性. 在Na+浓度低于200 mmol/L且单独存在时,没有切割产物生成．相反,在Na⁺和Mg^2+共存时,表现出Na⁺抑制Mg2+诱导的切割活性,切割效率明显低于Mg²⁺单独存在时的结果.这些结果提示,在生理环境下,Mg²⁺对于多核酶系统对底物的切割反应是必需的,而Na⁺则不是．     

Caspase-3参与调控蟾酥诱导人肺腺癌(ASTC-a-1)细胞的凋亡

采用基因质粒转染技术、荧光发射谱检测分析以及荧光共振能量转移(FRET)受体光漂白技术,首次在活细胞中实时检测中药蟾酥(Chan-Su,CS或bufonis venenum)诱导人肺腺癌(ASTC-a-1)细胞凋亡过程中caspase-3的活化特性.采用CCK-8(Cell Couneing Kit-8)技术检测发现,蟾酥对细胞的活性具有显著的抑制作用;蟾酥处理稳定表达FRET质粒SCAT3的人肺腺癌细胞后,在不同的时间检测活细胞中SCAT3的荧光光谱;利用共聚焦扫描荧光显微成像技术检测蟾酥处理后细胞的形态,从而进一步证实蟾酥诱导细胞凋亡.实验结果表明:a.蟾酥可以有效抑制人肺腺癌(ASTC-a-1)细胞的增殖活性并诱导细胞的死亡.蟾酥对细胞的抑制作用具有剂量依赖性;b.蟾酥处理细胞6 h后能检测到明显的细胞凋亡小体,连续作用24 h后细胞全部皱褶,并有部分细胞破碎;c.蟾酥作用细胞2 h就能明显切割细胞内的SCAT3,细胞内SCAT3的切割程度随着蟾酥作用时间的延长而增加,24 h内细胞内的SCAT3完全被切割.受体光漂白实验也证实了该结论,表明caspase-3参与调控了蟾酥诱导的细胞凋亡过程.     

小麦6B染色体微切割及其不同片段的DNA文库构建

用Nd∶YAG激光微束将处于有丝分裂中期的小麦(Triticum aestivum L.)6B染色体微切割为四段,并用微细玻璃针将每个片段分别回收。将分离的染色体片段DNA用Sau3A接头介导的多聚酶链式反应(LA-PCR)分别扩增。Southern杂交证明4个特定区域的DNA确实来自于小麦基因组。用一系列(42对引物)位于6B染色体和其他染色体上的微卫星序列对微切割的染色体片段的PCR产物进行了验证。结果表明,获得的染色体片段的PCR产物来自于小麦6B染色体。将6B染色体4个片段的第二轮PCR产物克隆到pGEMT-vector中,建立了4个染色体特定区域的基因组文库,命名为R1、R2、R3和R4,分别包含2.1×10~5、2.74×10~5、2.45×10~5和2.93×10~5个重组子克隆。每个文库均随机挑选150个克隆进行质粒的小量制备和酶切验证。结果显示:插入片段大小在300～1800 bp之间,平均大小为820～870 bp,其中43％～48％的克隆为低/单拷贝序列,42％～47％为中/高拷贝序列。本研究为详细分析植物单染色体的不同片段的分子遗传学研究提供了基础。     

丙型肝炎病毒被膜蛋白E1信号序列的切割受下游序列的影响

在痘苗病毒／T7系统中构建并表达了不同结构的丙型肝炎病毒（HCV）结构蛋白质基因片段。比较不同结构中E1信号序列的切割效率,发现E1信号序列下游E1或E2序列缺失都降低了E1信号序列切割加工的效率。将被膜蛋白序列E1－E2替换成长度相当的β－兰乳糖苷酶序列后也降低了该位点的切割效率,表明完全的E1信号序列的切割与下游相对完整的被膜蛋白E1、E2序列的存在关系。计算机辅助分析发现E1信号序列是一个很典型的信号序列,然而,实验结果却表明其切割效率受其下游序列的影响。这种依赖于上下游序列的信号序列加工目前仅发现存在于IL－12信号序列加工和黄病毒C／prM位点（prM信号序列）的加工。由于黄病毒和HCV均属黄病毒科,这种在同一科内具有相类似的异常的信号序列加工,其生物学意义值得深入研究。     

染色体显微切割与DOP—PCR结合对赤麂Sry基因克隆，测序及初步定位

应用显微切割技术获得赤麂1号,Y1,Y2染色体,通过DOP－PCR增加模板DNA拷贝数,然后用人的性别决定基因（Sex-tetermininig Region of the Chromosome Y,SRY)中HMG框内设计1对引物,对DOP－PCR产物进行扩增,在雄性赤麂Y2染色体DOP－PCR产物中扩增出与人SRY基因同源的Sry基因片段,克隆,测序,首次在分子水平上证明赤麂Y2染色体是真正的Y染色体,同时对赤麂Syr基因进行了初步定位。