N-糖基化位点突变的人IFN-λ1在毕赤酵母中的表达、纯化及表征（英文）

IFN-λ1是Ⅲ型干扰素家族的一个成员,具有与Ⅰ型干扰素相似的功能。此前,我们已经从毕赤酵母表达获得了可溶性重组人干扰素-λ1。然而,毕赤酵母表达中的高糖基化带来了免疫原性,影响了蛋白质的生产纯化效率。为了克服这个缺点,文中构建了一种干扰素突变体(rhIFN-λ1-Nm),定点突变潜在糖基化位点。AOX1启动子与α因子信号序列存在的情况下,用甲醇诱导成功地实现了rhIFN-λ1-Nm在毕赤酵母GS115胞外分泌表达。对rhIFN-λ1-Nm进行纯化,获得了纯度98%的产品,并对糖化水平、分子量、二级结构、N末端序列等理化性质和生物活性进行了研究。研究结果表明,rhIFN-λ1-Nm糖基化水平明显降低,蛋白质生产纯化收率显著提高,而对结构和生物活性无影响;糖基化位点突变rhIFN-λ1可以被开发为IFN-λ1的替代品,有望发展成为未来的生物免疫制剂。     

“缺口翻译”法制备~(32)P 标记DNA探针和几种核酸杂交技术

定性或定量检测天然DNA或重组DNA中某些特殊的顺序片段,分子杂交是最常用的方法。近几年,核酸的分子杂交技术日趋完善,以不同材料为支持物的固相杂交技术取得了更为迅速的发展。核酸分子杂交方法的灵敏性主要取决于同位素标记杂交探针的比放射性强度。因此制备高比放射性探针是提高灵敏性的关键。用缺口翻译方法制备较稳定的高比放射性强度的杂交探针,大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ是一个理想的工具。本文介绍我们建立并改进“缺口翻译”制备P标记的探针方法,以及几种重要的核酸固相杂交技术。     

恒河猴高重复顺序DNA的分子克隆

哺乳动物基因组中高重复顺序可用限制性内切酶消化DNA经用电泳分离获得,本文用限制性内切酶Bam HI消化恒河猴DNA分离得到一系列高重复片段。用其中最小片段与质粒pBR 322共价连接,转化到大肠杆菌后得到3个带有重组子的克隆。其中PMBI克隆用Bam HI,Pst I酶解,杂交鉴定,证明此克隆是含有重组的恒河猴高重复片段,此片段大小约为340碱基对。哺乳动物基因组相当繁杂,一般在10~9碱基对(b.p)以上,应用复性动力学方法可将其分成高重复顺序、中重复顺序及单拷贝顺序。高重复顺序在基因组中重复频率很高。可达百万次。它有许多家族,这些家族核苷酸顺序相近,但不相同,目前有证据表明,高重复顺序与基因表达及调控有关,与生物进化有关,而且还与DNA的复制及调控有关,因此具有重要的生理功用。为了得到纯的单一高重复顺序,我们应用分子克隆技术,建立了恒河猴高重复顺序DNA的分子克隆。     

重组EpoAB-NGF模拟肽的神经营养功能

目的:研究重组融合蛋白红细胞生成素AB肽-神经生长因子模拟肽(EpoAB-NGF9和EpoAB-NGF/12)的神经营养作用。方法:构建pET-42a-EpoAB-NGF9/12原核表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),以IPTG诱导表达,亲和层析纯化重组蛋白,显微镜观察PC12细胞诱导分化,流式细胞仪检测凋亡细胞。结果:大肠杆菌表达的重组融合蛋白GST-EpoAB-NGF9/12分子量约为30kDa,抗GST抗体免疫印迹反应呈阳性。融合蛋白可以诱导PC12细胞分化,促进轴突生长。R2L1细胞去血清培养,凋亡细胞占(31.7±0.60)%,去血清后加入融合蛋白GST-EpoAB-NGF9/12,细胞凋亡率分别为(25.2±3.52)%、(25.7±1.46)%,呈现一定程度的抑制细胞凋亡的活性。结论:重组EpoAB-NGF模拟肽融合蛋白具有与NGF类似的神经营养作用。     

HBV－NC1株X基因在真核细胞中表达，基因调控与致癌作用的初探

报道了ＨＢＶ－ＮＣ１株的Ｘ基因进入真核细胞表达载体ｐＸＴ１质粒的ＴＫ启动子之后,转染细胞及表达Ｘ基因成功。即发现包装病毒感染ＮＩＨ／３Ｔ３细胞后有Ｘ基因表达,用斑点杂交又证明此Ｘ基因已整合到细胞的基因组中,当与有ｐＭＳＨ报告基因的质粒共同感染真核细胞后确有激活转录调控现象出现。应用反义的ＸＲＮＡ表达载体感染肝癌细胞发现有接触抑制作用出现。     

一例性反转畸形SRY基因片段的扩增、克隆和核苷酸序列分析

在哺乳动物中,位于Ｙ染色体上的指导雄性性别分化的基因被命名为睾丸决定因子（Ｔｅｓｔｉｓ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇｆａｃｔｏｒ,ＴＤＦ）１９９０年６月分离获得的ＳＲＹ基因（Ｓｅｘ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇｒｅｇｉｏｎｏｆｔｈｅＹ）被认为是ＴＤＦ基因最好的候选者［１－４］。ＳＲＹ基因为单拷贝,位于Ｙ染色体短臂末端１Ａ１Ａ区,靠近假常染色体配对区（ＰＡＰＲ）的交界处,其部分顺序编码８０个保守性氨基酸组成的多肽。本实验使用与ＳＲＹ基因相应的引物,利用ＰＣＲ技术以一例性反转畸形病人的基因组ＤＮＡ为模板分离ＳＲＹ基因保守区顺序,并将特异扩增出的此ＳＲＹ基因片段重组到质粒ｐＵＣ１２中,得到含有ＳＲＹ基因片段的克隆。经测序表明其ＳＲＹ基因保守顺序上有Ｔ→Ｃ（Ｓｅｒ→Ｐｒｏ）突变。ＳＲＹ基因的存在及其突变可能是导致性反转畸形发病的原因。