GAL4/UAS系统在转基因技术中的应用研究进展

GAL4/UAS系统是一种转基因技术体系,其原理是利用特定的启动子或增强子,以组织特异性的方式激活酵母转录激活子GAL4的表达,GAL4又以同样的方式引起GAL4反应元件(UAS)-靶基因的转录。GAL4/UAS系统的关键点在于:GAL4基因和UAS-靶基因分别存在于两个转基因系中。GAL4转基因系中有转录激活子,但没有靶基因;在UAS-靶基因系中,转录激活子不存在,因而靶基因处于沉默状态,只有将GAL4转基因系与UAS-靶基因系进行杂交,才可能产生表达靶基因的后代。本文综述了GAL4/UAS系统的建立及其研究应用。     

枇杷叶的化学成分

枇杷叶系蔷薇科（Rosaceae）枇杷属植物枇杷[Eriobotrya japonica（Thunb．）Lindl．]的干燥叶,为常用中药,收载于历版《中华人民共和国药典》中。枇杷叶归肺、胃经,具清肺止咳、降逆止呕的作用,用于治疗肺热咳嗽、气逆喘气、胃热呕逆及烦热口渴之症状。目前,已经从枇杷叶中分离出三萜酸、黄酮类、多酚、倍半萜及其苷类等成分,对其药效的研究主要集中在三萜酸的抗炎心、降血糖和抗病毒活性等方面。     

NO和茉莉酸甲酯对黄芩悬浮细胞生长及黄芩苷合成的影响

以硝普钠(sodium nitroprusside,SNP)为一氧化氮(nitric oxide,NO)的供体,向黄芩(Scutellaria baicalensis)悬浮培养细胞系中添加SNP和茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MJ),考察这两种诱导子在不同的添加时间、添加浓度及混合配比使用对黄芩悬浮细胞系生长和黄芩苷含量的影响。研究结果表明：低浓度的外源NO有利于细胞的生长,但对黄芩苷积累无作用,而MJ有利于黄芩苷的合成,但抑制细胞生长,且两者的适用浓度范围和添加时间存在差异。在细胞培养初期(0天)添加0.05 mmol·L~(-1)SNP,而在细胞生长对数中期(8天)添加10μmol·L~(-1)的MJ,细胞鲜重可达到对照的1.2倍,黄芩苷总量达到对照的2.96倍。     

创伤弧菌vvhA基因的克隆、原核表达系统的构建及鉴定

目的 克隆创伤弧菌（Vibrio vulnificus,Vv）溶细胞素基因（υυhA）,构建原核表达系统并鉴定其表达产物的免疫性.方法 采用PCR技术从Vv GTC333和WZ01株DNA中扩增全长υυhA基因,T-A克隆后测定其核苷酸序列.采用pET32a质粒构建vvhA基因原核表达载体,在E coli BL21（DE3）宿主菌中用不同浓度的IPTG诱导目的重组蛋白rVvhA表达,采用Ni-NTA亲和层析法提纯rVvhA,SDS-PAGE检测表达和提纯效果.采用兔抗Vv全菌抗体的Western Blot和兔抗rVvhA血清的免疫扩散试验鉴定其免疫反应性和免疫原性.结果 所克隆的vvhA基因核苷酸序列与GeneBank公布的同源性分别为96.09%和98.26%.在0.5 mmol/L IPTG诱导下,rVvhA产量可占细菌总蛋白的18%.提纯的rVvhA经SDS-PAGE后仅显示单一的蛋白条带.重组蛋白rVvhA能与兔抗Vv全菌抗体发生特异性结合,免疫家兔可获得高效价抗体.结论 该研究成功地构建了创伤弧菌υυhA基因高效原核表达系统,所表达的rVvhA具有良好的免疫原性和免疫反应性,可作为Vv免疫检测试剂盒及疫苗的抗原.     

不同杆状病毒诱导哺乳动物细胞抗病毒效果比较分析

杆状病毒常常包埋在由蛋白质组成的包含体中, 根据包含体的形态及其他理化性质, 将杆状病毒划分为核多角体病毒属和颗粒体病毒属两个属, 分子进化分析将核多角体病毒进一步划分为GroupⅠ和GroupⅡ两组. 研究发现, GroupⅠ的AcMNPV能刺激SMMC-7721和WISH细胞产生抗病毒的活性, 获得抵抗水疱口膜炎病毒(vesicular stomatitis virus, VSV)感染的能力, 但在BHK细胞和L929细胞中不能诱导抗病毒作用; 而GroupⅡ的HaSNPV和SeMNPV对实验的哺乳动物细胞均不能诱导其产生抗病毒作用. AcMNPV诱导哺乳动物细胞抗病毒作用是诱导干扰素α/β的产生. 转导分析表明, AcMNPV并不能介导哺乳动物启动子控制的报告基因在SMMC-7721细胞中表达, 但在WISH, BHK和L929细胞中能介导转基因的表达, 说明AcMNPV诱导抗病毒状态与介导转基因的表达不是相关的.     

APE/Ref-1在中枢神经系统氧化应激反应中的保护作用

化学性质活泼的自由基（free radicals）在保持产生和清除平衡的稳衡性动态下能履行正常的生理功能,但超过生物体的清除能力则可导致多种疾病.无嘌呤/无嘧啶核酸内切酶/氧化还原因子1（apurinic/apyrimidinic endonuclease/redox-factor 1, APE/Ref-1）是一种体内分布广泛的多功能蛋白质,通过修复DNA的无嘌呤/无嘧啶（apurinic/apyrimidinic, AP）部位参与DNA的碱基切除修复(base excision repair, BER).APE/Ref-1还可通过还原许多转录因子的半胱氨酸残基使之易于与DNA结合而调控真核细胞的基因表达.APE/Ref-1的抗细胞凋亡作用使其在自由基所致中枢神经系统病变如脑缺血-再灌注损伤、神经退行性病变、脑动脉粥样硬化中发挥了重要作用.     

高转移倾向乳腺癌细胞中p-ERK促进增殖和迁移作用的信号转导途径

在建立乳腺癌细胞MCF-7高转移倾向亚克隆LM-MCF-7细胞株的基础上,为阐明LM-MCF-7细胞具有更强增殖和迁移能力的分子机制,对其相关分子及其信号转导途径进行了探讨.免疫印迹结果显示,与MCF-7细胞相比,LM-MCF-7细胞中p-ERK1/2水平显著升高.流式细胞术和“伤口愈合”实验结果表明,ERK1/2的特异性抑制剂PD98059可明显抑制LM-MCF-7细胞的高增殖和高迁移能力.免疫印迹检测发现,与MCF-7细胞相比,LM-MCF-7细胞中与增殖和迁移相关的因子,如β-catenin、细胞周期蛋白D1、磷酸化肌球蛋白轻链（p-MLC）和肌球蛋白轻链激酶（MLCK）的水平呈明显增高,PD98059对这些因子水平的增高具有抑制作用.免疫荧光染色显示,LM-MCF-7细胞中β-catenin分布在细胞核中,应用PD98059处理后,β-catenin主要分布在胞浆中.上述研究结果表明,在LM-MCF-7细胞中活化的ERK1/2水平升高,是导致该细胞增殖和迁移能力增强的重要原因之一,与ERK1/2-MLCK-p-MLC和ERK1/2-β-catenin 细胞周期蛋白D1等信号转导途径有密切的关系.     

重症肌无力小鼠模型的建立

目的建立重症肌无力小鼠模型。方法电鳗乙酰胆碱受体(TnAChR)和完全弗氏佐剂(CFA)混合物免疫C57BL/6J小鼠,经二次加强免疫后,检测肌力、腓肠肌肌电图、膈肌终板电镜、血清抗体水平等指标。结果与对照小鼠相比,发病小鼠表现出肌力减弱的症状,肌电图显示小鼠腓肠肌复合动作电位振幅幅度显著下降,电镜证实神经肌接头处突触后膜变平、皱褶减少、空泡样变性,发病小鼠血清抗体水平明显升高。结论成功建立了重症肌无力小鼠模型,有助于探讨其发病机理及探索治疗自身免疫病新的途径和方法。     

p21HBsAg/HBsAg转基因小鼠肝脏病理学研究

目的观察p21HBsAg/HBsAg转基因小鼠肝脏病理学改变.方法分别选取2、6、12、18、24月龄的SPF级p21HBsAg/HBsAg转基因小鼠和p21+/+野生型小鼠,剖检进行大体观察,取肝脏及肝脏肿瘤组织,进行组织学HE染色及电镜超微结构观察.结果 p21HBsAg/HBsAg转基因小鼠肝脏大体、光镜和电镜下均有明显病理改变.随着月龄的增加,肝脏色暗质硬,表面有结节和肿瘤形成;光镜下,肝细胞浊肿,炎症细胞浸润,脂肪变性,点状、灶状和碎屑状坏死,非典型增生,肝细胞癌.癌细胞分化良好,类似肝细胞,形成索状和腺泡状结构.癌细胞核深染,具核分裂像.电镜下,癌细胞核变形,核膜曲折凹陷,线粒体肿胀,数目增多,嵴减少.4例18月龄转基因小鼠发生肝细胞癌(4/10),6例24月龄的转基因小鼠发生肝细胞癌(6/10),其中2例发现远处转移.结论 p21HBsAg/HBsAg转基因小鼠肝脏出现明显病理损害,18月龄小鼠开始发展成高分化的肝细胞癌,高龄小鼠形成的肝细胞癌能够转移.     

人乳头瘤病毒6型L1基因的克隆和表达及鉴定

克隆人乳头瘤病毒6型(HPV-6)保护性抗原L1基因,构建L1基因表达载体。从临床诊断尖锐湿疣的病理组织标本中提取HPV-6的DNA,采用高保真PCR扩增其保护性抗原L1基因,T-A克隆后测定核苷酸序列。构建pET32a的L1表达载体,在E.coliBL21DE3宿主菌中用不同浓度的IPTG诱导表达。采用SDS-PAGE鉴定表达产物。所克隆的L1基因与报道的相应核苷酸序列同源性为99.20%~99.93%,氨基酸序列同源性高达99.80%~100%。SDS-PAGE结果显示,在构建的载体中成功表达预计大小分子量的融合蛋白,成功构建了HPV-6的保护性基因L1的表达系统。