甲型H1N1流感病毒在季流病毒、禽流感病毒共感染时变异可能性的验证

目的 甲型H1N1流感病毒A/California/7/2009分别与A/Brisbane/10/07和A/ShenZhen/406H/06共感染小型香猪,预测甲流病毒在与季流H3N2病毒/甲流病毒与禽流感病毒共感染时是否会发生变异.方法 分别将A/California/7/2009(CA7)与A/Brisbane/10/07(H3N2),A/California/7/2009与A/Shenzhen/406H/06(H5N1)对5～6月龄小型猪共感染,小型猪经复方氯胺酮0.1 mL/kg麻醉后进行滴鼻感染,感染后第5天安乐死动物,取动物肺组织作病毒测序分析.结果 A/California/7/2009(CA7)与A/Brisbane/10/07(H3N2)共感染后,A/California/7/2009病毒PB1基因993位G→A突变,PA基因1659位G→A突变,没有氨基酸的变异.A/California/7/2009与A/Shenzhen/406H/06(H5N1)共感染后A/California/7/2009病毒PB2基因1711位T→C突变.碱基的突变未引起氨基酸的变异.结论 A/California/7/2009(CA7)与A/Brisbane/10/07(H3N2),A/California/7/2009与A/Shenzhen/406H/06(H5N1)共感染后在猪的体内没有发生病毒重组、变异.     

改良的硫酸铵沉淀法纯化大雁的卵黄抗体

目的 探索有效的纯化大雁卵黄抗体及高效价二抗的方法。方法 应用了PEG沉淀,阴离子交换柱,硫酸铵分级沉淀纯化,免疫制备二抗,免疫电泳和免疫双扩散法及western blotting进行效价的测定。结果 改良后的硫酸铵沉淀法的纯度远远高于PEG沉淀,相对于离子交换法而言更加简单方便,经济省时。从免疫电泳看已达到了电泳纯,大雁卵黄IgY的相对分子质量为180×10^3,重链约为66×10^3,轻链约为24×103。免疫获得的二抗有较强的免疫活性。结论 用改良的硫酸铵沉淀法纯化大雁卵黄抗体,效率和纯度显著提高,值得推广。本实验为大雁卵黄抗体及其二抗的应用奠定了基础,也为雁形目其他种类卵黄抗体的纯化提供了参考。     

黄鳝IgM的分离纯化及兔抗黄鳝IgM抗血清的制备

目的 分离纯化黄鳝血清免疫球蛋白,制备其兔抗血清,并检测抗血清的特异性。方法 用Protein A亲和层析的方法纯化黄鳝血清免疫球蛋白,通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛋白的纯度,免疫大耳白兔制备抗血清,利用免疫双扩散检测抗血清的效价,通过western blotting检测抗血清的特异性。结果 纯化了黄鳝血清免疫球蛋白,免疫双扩散法测定兔抗黄鳝免疫球蛋白血清效价为1∶32,western blotting结果显示抗血清具有很好的特异性。结论 成功纯化了黄鳝免疫球蛋白,制备了兔抗黄鳝IgM抗血清,为建立黄鳝的血清学检测系统奠定了基础。     

貉血清IgG纯化及抗血清的制备

目的 制备高纯度貉血清IgG和兔抗貉IgG抗血清,作为建立多种动物抗体检测技术的储备。方法 采用Hitrap Protein A亲和层析及盐析再沉淀法纯化貉血清IgG,通过PAGE电泳和Western-Blot免疫印迹法对IgG作纯度及免疫活性检测;常规免疫法制备兔抗貉IgG血清。结果 貉血清IgG与Protein G虽有较强的结合力,但同时也结合血清中其他杂蛋白;用二步纯化法可从5 mL貉血清中纯化IgG约7 mg,电泳和免疫印迹测定显示,IgG纯度大于95%,常规免疫法制备抗血清免疫双扩散效价达1∶32。结论 建立了可行的貉血清IgG的纯化方法和高效价的兔抗貉血清IgG抗血清,为貉血清IgG二级抗体酶联物的制备储备了资源。     

人ACE2转基因小鼠对SARS-CoV的易感性

目的建立敏感的SARS小动物模型。方法通过显微注射技术,将编码SARS-CoV细胞受体的人血管紧张素转换酶(hACE2)基因导入小鼠的基因组中制备了hACE2转基因小鼠,在小鼠ACE2(mACE2)启动子的调控下,hACE2蛋白在转基因小鼠的肺脏、心脏、肾脏和小肠表达。我们观察了野生型和转基因小鼠在SARS冠状病毒接种后病原学和病理学方面的反应。结果在接种后第3天和第7天,病毒能够更有效地在转基因小鼠的肺脏复制,而且转基因小鼠出现更严重的肺损伤。肺组织的损伤包括肺间质充血、出血,单核细胞、淋巴细胞浸润及血浆蛋白的渗出,肺泡上皮细胞增生、脱落,此外,在转基因小鼠的某些器官还发现了血管炎、变性和坏死等病理变化。在转基因小鼠的肺上皮细胞、血管内皮细胞和脑神经细胞检测到病毒抗原。结论转基因小鼠比野生型小鼠对SARS病毒更易感,而且表现出更接近SARS患者的病理变化。     

牛磺胆酸作用下副溶血弧菌全基因组比较转录谱的表达分析

目的利用DNA芯片技术研究副溶血弧菌对牛磺胆酸刺激反应的全局性基因转录变化概况,找出其中的表达调控变化规律,为副溶血弧菌基因转录调控网络的构建提供实验和理论依据。方法副溶血弧菌分别在正常和添加了50mmol／L牛磺胆酸的培养基中孵育至对数中期,收集菌体,提取RNA,利用全基因组DNA芯片分析比较两者基因转录变化。并应用聚类分析比较其中的变化规律。结果比较转录谱分析证实一共有255个基因的转录表达发生显著性变化,和对照组相比,上调的基因明显占主导优势。而在这些变化的基因中,关于蛋白合成和硫代谢以及谷氨酸合成相关的基因均呈现明显的转录上调变化。结论我们利用DNA芯片技术描绘出了副溶血弧菌在添加牛磺胆酸后全部基因转录水平变化的概图,并发现了蛋白合成,硫代谢和谷氨酸合成相关的基因的变化规律,这给我们下一步的转录调控网络研究提供了良好的靶标。     

食蟹猴脑出血模型的建立及评价

目的建立稳定的食蟹猴自体股动脉抗凝血脑出血模型。方法健康成年食蟹猴8只,采用新鲜抗凝自体股动脉血1．5mL,立体定向一次性缓慢匀速注入右侧基底节区屏状核内侧,利用MRI、PET、神经功能缺损评分和组织病理学对模型进行评价。结果动物在麻醉苏醒后出现了与血肿部位相对应的神经系统定位体征,影像学检查血肿腔位于右侧基底节,注血部位大片代谢缺损区,中线向左侧移位。组织病理学检查损伤局部周围可见多量泡沫细胞、淋巴细胞及单核巨噬细胞浸润,部分损伤脑组织已被肉芽组织机化。结论自体股动脉抗凝血定向脑内注射法可建立稳定、可靠的食蟹猴脑出血模型,注血量、注血部位和速度是模型成功与否的关键。     

人参皂甙Rb1抑制扩张型心肌病发生中的HB-EGF表达和纤维化

目的HB-EGF过表达可促进心肌纤维化及心肌细胞凋亡,本文研究人参皂甙Rb1对cTnT^R141W转基因扩张型心肌病小鼠发病过程中的HB-EGF表达和心肌纤维化的影响。方法将cTnT^R141W转基因小鼠随机分为模型组和人参皂甙Rb1组（70 mg/kg/d）,连续给药7个月,取野生型小鼠作为对照组。用Kaplan-Meier法进行生存分析。心脏超声检测心功能及心脏几何构型。计算心重指数。光镜观察心肌细胞及间质变化。Western blot检测心脏HB-EGF,pSTAT3表达水平。结果Rb1长期给药能显著改善该模型的心功能和心脏几何构型,将死亡率降低50%。Rb1治疗组心重指数降低11.3%（P〈0.05）,光镜观察显示Rb1能减轻心肌细胞排列紊乱以及间质纤维化。Western blot结果显示Rb1能够显著降低模型中的HB-EGF及pSTAT3的表达。结论Rb1抑制心肌病发生中的HB-EGF表达及抑制下游信号pSTAT的激活,并改善扩张型心肌病模型的心功能及心脏重构。     

帕金森病α-Synuclein转基因小鼠模型中G蛋白偶联受体激酶5的表达

目的观测G蛋白偶联受体激酶5（G protein-coupled receptor kinase,GRK5）在帕金森病α-synuclein转基因小鼠模型中的表达变化情况,了解GRK5在帕金森病中的可能作用,为发现帕金森病发病机制和探索更好的治疗方法提供新的方向。方法采用Western blotting和实时荧光定量PCR技术对具有不同的人alpha synuclein（hα--syn）表达水平的帕金森病α-synuclein转基因模型小鼠以及3月龄,6月龄以及9月龄A53T突变型帕金森病α-synuclein转基因模型小鼠脑组织进行GRK5的RNA和蛋白水平检测,与同窝阴性对照小鼠进行比较。结果各组帕金森病α-synuclein转基因小鼠与阴性对照小鼠相比,GRK5蛋白表达水平均有不同程度的增加,并且随着转入的hα--syn蛋白表达水平的高低而有所变化。3月龄和6月龄帕金森病转基因模型小鼠与同月龄阴性对照组小鼠相比,GRK5的mRNA和蛋白水平没有变化;而9月龄帕金森病转基因模型小鼠与同月龄阴性对照组小鼠相比,GRK5的mRNA和蛋白水平都有所增加。结论帕金森病α-synuclein转基因模型小鼠具有更高表达水平的GRK5。     

肠道病毒71型（EV71）对ICR小鼠的感染

目的研究肠道病毒71型经不同途径感染不同日龄ICR小鼠后的感染状况,了解肠道病毒71型的感染特点,为了解EV71小鼠感染机制和模型制备提供实验信息和技术支撑。方法分别通过口腔途径、颅腔途径、肌肉途径及腹腔途径感染1日龄、7日龄及3~4周龄SPF级ICR小鼠,定期安乐动物,采集各器官组织进行病原学诊断,确定EV71病毒感染情况;同时建立一步RT-PCR、病毒分离、IFA及IEA等方法。结果经腹腔途径感染成年鼠出现竖毛、弓背、消瘦症状,其他各途径感染小鼠感染后未见竖毛、弓背、觅食减少、体重减轻、精神呆滞及神经系统症状。颅腔注射3~4周龄ICR小鼠能在脑组织检测到病毒RNA,腹腔注射和肌肉注射1日龄乳鼠能在肌肉组织和肠道检测到病毒RNA,其中,肌肉组织病毒分离可检测到活病毒。本研究同时建立了分子生物学、血清学方法,为今后研究其它适合EV71的动物模型奠定了基础。结论临床分离的EV71毒株通过口腔接种、颅腔、肌肉、腹腔注射途径感染1日龄、7日龄及3~4周龄SPF级ICR小鼠的疾病程度和病毒检出不同,ICR乳鼠及成年鼠可作为该病毒感染机制、病毒体内分布等基础研究,但用作EV71动物模型应用,感染程度尚不十分理想。