CD14蛋白表达、纯化及单克隆抗体制备

摘要 目的：制备CD14重组蛋白及抗CD14单克隆抗体。方法：从人外周血淋巴细胞中克隆CD14编码基因,将其连接至质粒pRSETC,构建表达质粒pRSETC/CD14,转染大肠杆菌表达菌株BL21(DE3),筛选阳性克隆、用IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测CD14蛋白表达水平,应用镍柱进行亲和纯化,SDS-PAGE及Western blot进行纯化产物鉴定。纯化后的CD14蛋白免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术筛选分泌单克隆抗体细胞株,制备单克隆抗体,利用Western blot鉴定抗体活性。结果：获得CD14编码基因,并成功进行了原核表达,SDS-PAGE显示CD14以包涵体形式表达,纯化产物的纯度超过95%。利用杂交瘤技术筛选出稳定分泌抗CD14抗体的细胞株,并制备了高纯度的单克隆抗体,抗体具有CD14蛋白结合活性。结论：成功表达纯化了CD14蛋白,并制备了抗CD14单克隆抗体,为后续开发CD14检测技术提供抗体。     

HCV NS5B蛋白对HCV RNA的模板特异性研究

在大肠杆菌菌株BL21(DE3)中表达并纯化HCV的依赖于RNA的RNA多聚酶(RNAdependentRNApolymerase,RdRp,NS5B蛋白)。以HCV正、负链RNA3′末端的序列为模板,体外研究NS5B蛋白催化的RNA合成。结果显示,正链RNA在体外不能指导RNA合成,而负链RNA模板可以产生一条全长的正链RNA产物,表明NS5B对负链RNA具有模板特异性。NS5B对负链RNA的特异性在模板竞争性实验中得到进一步证实,正链RNA的存在和竞争对以负链为模板的RNA合成没有影响。这样,就合理解释了在HCVRNA复制时正链RNA的数量远比负链RNA多这一问题。同时,本实验的结果也为进一步研究病毒或其它细胞因子参与以正链RNA为模板进行的RNA合成,以及有关负链RNA模板特性的研究奠定了基础。     

灵芝多糖GLP的抗疱疹病毒作用机理

从灵芝菌丝体中分离得到的多糖GLP具有抑制单纯疱疹病毒Ⅰ型感染的作用,并对GLP抑制疱疹病毒复制的作用机制进行了初步探讨.GLP对Vero细胞的CC50值大于2 000μg/mL,GLP在疱疹病毒感染细胞前、感染后和病毒感染细胞时加入到细胞悬液中的EC50分别为4.6、50和17μg/mL;而如果将GLP与细胞共同孵育后再用病毒去感染,其EC50为11μg/mL.同时,GLP抑制病毒感染的选择指数分别为435、40、118和182.如果在病毒感染细胞后加入GLP,在病毒的生物大分子的合成完成后而子代病毒粒子还未释放出来前去掉GLP,这时GLP对病毒感染就没有抑制作用.定量PCR试验进一步证明GLP发挥抑制疱疹病毒感染作用是通过阻断病毒感染细胞早期与细胞表明蛋白的吸附来实现的.     

利用果渣产黄腐酸菌剂的筛选

以果渣发酵生产黄腐酸可实现农业有机固定废弃物的资源化利用。从腐植酸样品中分离获得4株耐高温菌,以果渣为基质发酵生产黄腐酸,通过测定黄腐酸产量和木质纤维素降解率,从中筛选出2株能够较好降解木质纤维素的黄腐酸生产菌株BFA02和BFA03,其黄腐酸产量分别为43.67、59.35 g/kg。经16S rDNA分类鉴定,初步确认BFA02为解淀粉芽孢杆菌,BFA03为地衣芽孢杆菌。选择季也蒙酵母、长枝木霉分别与BFA02、BFA03复配发酵生产黄腐酸。结果表明,复合菌剂发酵生产黄腐酸产量高于单菌发酵。其中,由BFA02、BFA03和长枝木霉组成的复合菌剂3实验组黄腐酸产量最高,达到103.19 g/kg,较BFA02、BFA03单菌发酵分别提高了136%和74%,其纤维素、半纤维素、木质素的降解率分别为46.25%、39.49%、37.5%,均高于单菌发酵。黄腐酸生产菌株与长枝木霉复配,能够有效促进木质纤维素降解率,提高黄腐酸产量,在果渣废弃物资源化利用领域有着极大的潜力。     

HCV 5A基因在Hela细胞中的稳定表达及对细胞生长的抑制现象

应用PCR技术从含有HCV(Hepatitis C virus)全长开放阅读框的质粒pBRTM/HCV 1-3011中获得NS5A全长基因片断,利用基因重组技术将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1(-)中.通过酶切、PCR及测序鉴定NS5A基因已正确插入到pcDNA3.1(-)中,再利用脂质体介导转染Hela细胞,48h后传代并利用pcDNA3.1(-)质粒上的neo抗性基因加入G-418进行筛选.大约两周后,获得稳定表达的细胞株.经RT-PCR及western blot验证,证实HCV的NS5A基因在Hela细胞中已经获得了表达.在培养条件完全一致的条件下,表达NS5A基因的Hela细胞与pcDNA3.1(-)转染的细胞相比,生长速度明显变慢,其倍增时间约为35-36h,比对照组细胞增加了约50%,而转染pcDNA3.1(-)的细胞的倍增时间与正常Hela细胞则无明显差别,都为23-24h.从而证明HCV的NS5A蛋白具有抑制Hela细胞生长的作用.     

大口黑鲈对六种非粮蛋白源的表观消化率

实验以0.1%三氧化二钇(Y₂O₃)为外源指示剂, 用“70%基础饲料+30%待测饲料原料”的方法配制实验饲料。测定初始体重为(19.28±0.10) g的大口黑鲈(Micropterus salmoides)对荚膜甲基球菌蛋白、乙醇梭菌蛋白、黄粉虫粉、酶解大豆、小球藻和棉籽浓缩蛋白的干物质、蛋白质、脂肪、能量和氨基酸的表观消化率。结果显示, 6种实验原料干物质的表观消化率在37.27%—86.43%(荚膜甲基球菌蛋白>乙醇梭菌蛋白>酶解大豆>黄粉虫粉>小球藻>棉籽浓缩蛋白), 其中荚膜甲基球菌蛋白干物质的表观消化率最高, 乙醇梭菌蛋白次之, 黄粉虫粉、酶解大豆和小球藻之间没有显著性差异, 均显著高于棉籽浓缩蛋白(P<0.05); 蛋白质的表观消化率在79.97%—88.45%(荚膜甲基球菌蛋白>乙醇梭菌蛋白>黄粉虫粉>酶解大豆>小球藻>棉籽浓缩蛋白), 其中荚膜甲基球菌蛋白和乙醇梭菌蛋白均显著高于酶解大豆、小球藻和棉籽浓缩蛋白(P<0.05); 脂肪的表观消化率在51.19%—97.48%(乙醇梭菌蛋白>荚膜甲基球菌蛋白>酶解大豆>小球藻>黄粉虫粉>棉籽浓缩蛋白); 能量的表观消化率在43.25%—85.43%(荚膜甲基球菌蛋白>乙醇梭菌蛋白>酶解大豆>黄粉虫粉>小球藻>棉籽浓缩蛋白); 水解总氨基酸表观消化率在70.52%—90.51%(荚膜甲基球菌蛋白>乙醇梭菌蛋白>黄粉虫粉>酶解大豆>小球藻>棉籽浓缩蛋白)。各原料17种氨基酸表观消化率变化趋势与蛋白质表观消化率变化趋势基本一致。综上所述, 荚膜甲基球菌蛋白和乙醇梭菌蛋白的脂肪、能量和氨基酸的表观消化率最高, 且和黄粉虫粉、酶解大豆及小球藻的脂肪、能量、氨基酸的表观消化率均优于棉籽浓缩蛋白。因此, 荚膜甲基球菌蛋白、乙醇梭菌蛋白、小球藻、酶解大豆和黄粉虫粉均是大口黑鲈比较理想的蛋白质来源, 可作为大口黑鲈饲料中替代鱼粉的候选物。     

施氮水平对库尔勒香梨光合产物分配的影响

以6年生库尔勒香梨为材料,用¹³C脉冲标记技术研究了150、300、450 kg N·hm^-2(分别用N₁、N₂、N₃表示)3个施氮水平下树体各器官生物量、碳积累量以及¹³C同化物的吸收分配特性。结果表明: 库尔勒香梨树体整株的生物量、碳积累量、¹³C固定量以及叶片的同化能力均随着施氮水平的提高而增加;根冠比则随施氮水平的提高而降低。生殖器官果实的生物量、碳积累量在N₂处理下最高。树体各器官¹³C含量和分配率随施氮量的增加发生动态变化。新梢旺长期,叶片和根系对光合同化物的竞争能力较强,且¹³C分配率均为N₁处理下最高;果实膨大期和成熟期,叶片和果实的竞争能力较强,叶片¹³C含量和分配率在N₃处理下最高,而果实¹³C含量和分配率则在N₂处理下最大。综上,根据不同施氮水平各器官对碳同化物的吸收分配特征,以提高产量为目标,建议6年树龄的库尔勒香梨果园最佳施氮量为300 kg·hm^-2。     

双氢青蒿素调控巨噬细胞增殖和迁移的作用研究

目的:探讨双氢青蒿素在体外对小鼠单核巨噬细胞RAW264.7的增殖、克隆形成、周期、凋亡和迁移的影响。方法:采用梯度浓度(2.5μg/m L, 5μg/m L, 10μg/m L, 20μg/m L)的双氢青蒿素处理RAW264.7细胞,利用CCK8实验检测双氢青蒿素对巨噬细胞增殖能力的影响,利用克隆形成实验检测双氢青蒿素对RAW264.7细胞克隆形成能力的影响,利用流式细胞术检测双氢青蒿素对RAW264.7细胞周期和凋亡的影响,利用划痕修复实验检测RAW264.7细胞迁移能力。结果:CCK8实验结果显示,双氢青蒿素可以显著抑制RAW264.7巨噬细胞的增殖能力,且抑制效果与双氢青蒿素的浓度呈正相关性。克隆形成实验结果显示,双氢青蒿素可以抑制细胞的克隆形成能力。双氢青蒿素处理使RAW264.7细胞G0/G1期比例显著升高,S期与G2/M期细胞比例显著降低。双氢青蒿素对巨噬细胞凋亡具有诱导作用,且凋亡诱导作用呈现浓度依赖的特性。划痕修复实验结果显示,双氢青蒿素可以显著抑制RAW264.7巨噬细胞的迁移能力。结论:双氢青蒿素可以导致巨噬细胞的细胞周期G0/G1阻滞,并且诱导细胞凋亡,对巨噬细胞增殖和迁移具有抑制作用。     

生物修复剂TF3对铅污染土壤的修复效果研究

为研究生物修复剂TF3(0.5 g·kg-1肠杆菌干菌体+20 g·kg-1生物炭+20 g·kg-1有机肥）对铅污染土壤的修复效果, 选取5种铅浓度土壤为研究对象, 采用盆栽实验方法, 研究施用修复剂TF3后, 铅在油菜体内的富集、转运, 以及土壤有效态铅、酶活性、微生物的响应。结果表明: TF3能够促进油菜生长、显著降低油菜地上部、地下部铅含量。与CK组相比, TF3组油菜地上部、地下部及总富集系数分别降低20.12%-71.91%、 37.75%-60.13%、22.45%-68.77%。TF3组显著降低土壤有效态铅含量, 降低23.10%-39.84%。添加TF3, 土壤四种酶活性和微生物数量都有不同程度的增加, 真菌、放线菌、细菌分别较CK组增加11.76%-40.00%、6.45%-25.61%、120.20%-290.24%。研究表明, TF3降低了污染土壤铅对油菜的胁迫作用, 可以作为修复铅污染的一种有效生物修复剂。     

“知己健康管理”在慢性疾病患者的应用

目的:探讨"知己健康管理"模式对社区慢性疾病患者中改变不良生活方式后所产生的效果。方法:对社区57例慢性疾病患者进行3个月的强化知己健康管理,采用自身对照方法对其管理前后的生活方式、行为改变、血压及血脂等变化进行比较。结果:管理后患者血压、体重指数、腰围、血糖、血脂等均得到改善(P<0.05)。结论:"知己健康管理"可以强化社区居民对疾病的认识,改变不良的生活方式,有利于疾病的控制及危险因素水平的降低。