果蝇心脏发育标记基因lbe的多克隆抗体制备

lbe是已经证明的心脏标记基因。为了深入研究lbe在心脏发育中的功能,需要获得lbe蛋白并制备其抗体。首先提取野生型成体果蝇的总RNA,反转录获得其cDNA文库,通过PCR克隆出lbe编码区序列,将其连接到pET-28a原核表达载体上。经酶切及测序鉴定后,质粒构建成功。将重组质粒（pET-28a-lbe）转化大肠杆菌菌株Rosseta,用IPTG诱导表达出融合蛋白,经Ni-IDA凝胶柱纯化后,最后将纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备lbe多克隆抗体,并用Western blotting检测抗体的效价和特异性。结果显示获得了lbe原核表达重组融合蛋白及高效价的特异性兔抗lbe多克隆抗体,为lbe功能的进一步研究奠定了基础。     

干旱胁迫下巨尾桉的形态可塑性和生理响应特征

以1月龄巨尾桉组培苗为材料,通过模拟雨季和旱季的土壤水分条件试验探讨干旱胁迫下巨尾桉幼苗形态的可塑性及生理响应特征.结果表明:与高水和中水处理相比,低水处理(13%左右土壤体积水分含量,模拟旱季土壤水分)导致巨尾桉幼苗生物量减少,叶片形态发生明显变化,总叶面积、叶片数、平均叶面积和比叶面积减少,而且叶片可溶性糖含量增加;但水分胁迫下巨尾桉生物量分配模式不变,叶片脯氨酸含量变化也不明显,叶片最大光化学量子效率(Fv/Fm)仍维持在正常水平.研究发现,干旱并未对巨尾桉光合能力和水分吸收策略造成过多影响,巨尾桉能通过限制生长、减少水分消耗来应对干旱胁迫,保证植株安全度过干旱同时又不会过度消耗当地环境水分,以利于维持当地旱季的水分平衡.     

针对Fbxl5基因关键结构域F-box的Crispr/Cas9打靶有效性分析

为了在动物体内研究Fbxl5基因是通过什么机制导致斑马鱼心脏出现突变表型,本文利用近几年兴起的CRISPR/Cas9打靶技术建立斑马鱼Fbxl5基因敲除品系。本文将打靶位点定位于Fbxl5的F-box结构域,也就是Fbxl5的第五号外显子上。首先经过基因打靶网站分析筛选出针对Fbxl5基因F-box结构域最适合的打靶位点,扩增出Fbxl5基因CRISPR/Cas9打靶双链DNA,并转录为RNA,与Hcas9共注射至斑马鱼胚胎。最后,在注射48 h后对Fbxl5基因CRISPR/Cas9打靶的有效性进行检测。首先在注射48 h之后收集胚胎提取基因组DNA,用特异性引物进行PCR扩增;将纯化后的Fbxl5基因PCR产物连接到p MD18-T载体,再经质粒提取,测序分析,通过与WT斑马鱼基因组序列进行比对发现Fbxl5-9号在PAM序列AGG下游缺失了4个碱基。证明该CRISPR/Cas9系统在敲除心脏发育候选基因Fbxl5是有效的,该研究为最终获得Fbxl5基因敲除斑马鱼奠定了良好的基础。     

低磷胁迫下云南松幼苗的生物量及其分配

对云南松幼苗进行低磷胁迫的实验表明:不同磷处理水平下云南松幼苗的总生物量、茎叶生物量和株高在处理间的差异极为显著;随着培养液磷浓度的降低,云南松幼苗茎叶生物量和总生物量下降,株高降低,侧芽数减少;总生物量与茎叶生物量之间存在极显著的相关关系和线性回归关系,总生物量随培养液磷浓度的降低而下降主要是由茎叶生物量随培养液磷浓度的降低而下降引起的。低磷胁迫下云南松幼苗的根系生物量并没有随培养液磷浓度的降低而明显减少,根系生物量保持在比较高的水平,低磷胁迫下的云南松幼苗主要以降低茎叶生物量为代价来提高根冠比并保持根系生物量在比较高的水平来维持整个生命。实验还表明,在培养液磷浓度0.03125~0.00781mmol·L-1之间或附近,存在着一个云南松幼苗对低磷忍耐的临界值。     

一个新的睾丸特异表达基因的克隆及功能的初步分析

运用“数据库消减杂交”(digital differential display)方法来筛选人类睾丸特异表达新基因,获得了有差异显示的代表新基因的克隆重叠群。挑选其中一个克隆重叠群HS．326528进行多组织RT—PCR,初步获得该重叠群在人睾丸中有高表达。从该重叠群的IMAGE出发,采用生物信息学的方法快速克隆了一个人类新基因的全长cDNA序列,其全长1044bp,开放阅读框为214～529bp,定位于15q26．2,编码由105个氨基酸组成、分子量为11．7kD、等电点为10．09的一个碱性蛋白,该蛋白与已知蛋白无明显的同源性,克隆实验证明该基因的阅读框完全正确,RT—PCR和Northern blot显示该基因在人类睾丸中特异表达,实时PCR结果表明：该基因在成人睾丸中高表达,在精子中有中度表达,在胚胎睾丸中低表达,推测该基因与精子的生成有关,命名为SRG8(homo sapiens spermatogenesis—related gene 8)(GenBank登录号：AY489187),该基因编码的蛋白定位于细胞核。流式结果分析表明,SRG8基因能够促使HeLa细胞由S期向G2期的转变,从而加速细胞的分裂。这些结果表明SRG8基因可能在睾丸的发育及精子的形成过程中起重要的作用。     

诱导二倍体和同源四倍体白菜细胞质雄性不育系不定芽培养基的筛选

以二倍体和四倍体白菜细胞质雄性不育系的子叶为外植体,采用正交设计研究TDZ(0.1、0.5、1.0 mg·L-1)、NAA(0.1、0.5、0.8 mg·L-1)和AgNO3(0、5、10mg·L-1)三因素三水平诱导不定芽的结果表明:二倍体的不定芽再生优化培养基为MS 1.0 mg·L-1TDZ 0.8mg·L-1NAA 5 mg·L-1AgNO3(其再生率为80.7%),三因素影响的顺序为:NAA＞AgNO3＞TDZ;四倍体的不定芽再生优化培养基为MS 0.5 mg·L-1 TDZ 0.5 mg·L-1 NAA 10 mg·L-1 AgNO3(再生率为83.3%),三因素影响的顺序为:AgNO3＞NAA＞TDZ.后者所需TDZ/IAA的比值低于前者.     

不同水分梯度下珍稀植物四数木的光合特性及对变化光强的响应

四数木是东南亚热带森林的代表植物之一,但林下自然更新困难,为国家二级保护植物。本研究对盆栽控水条件下的四数木幼苗为材料,重点讨论了四数木幼苗净光合速率（Pn）、气孔导度（Gs）、胞间CO2浓度（Ci）、叶面水汽压亏缺（VPD）对光照强度（PAR）变化的响应。研究表明：四数木幼苗在各个水分梯度下的光饱和点（LSP）、最大净光合速率（Pmax）均较文献报道过的其他当地演替后期物种更高,光强突然由饱和光降至有限光时净光合速率（Pn）变化成V型曲线,稳定光强下胁迫水分处理组净光合速率低于饱和处理组,但各水分梯度下四数木幼苗对光强变化的响应时间无明显差异。四数木应属阳性植物,林下郁闭生境并不利于其更新,但其成年植株较长的寿命和较高的层次可能使其在群落演替的整个过程中都对林下环境的维持具有持续性贡献。     

不同磷源对云南松幼苗生长和磷吸收量的影响

磷是控制生命过程的重要元素,植物在生长过程中需要大量的磷,低磷常导致一些植物发生适应性变化.云南松(Pinus yunnanensis Franch.)对低磷土壤环境表现出了很强的适应能力,广泛分布并正常生长于贫瘠的低磷红壤上,研究不同磷源对云南松幼苗生长和磷吸收量影响,对揭示云南松的低磷适应机理具有重要参考意义.试验所用培养云南松幼苗的种子采集自云南省通海县秀山森林公园内的健壮云南松林.试验研究了不同磷源对云南松幼苗茎高、主根长、生物量、根冠比、磷含量的影响,结果表明:(1)不同磷源处理间云南松幼苗茎高(F=2.352,P=0.067)、主根长(F=1.775,P=0.151)、茎叶生物量(F=1.359,P=0.269)、根系生物量(F=2.807,P=0.035)和总生物量(F=1.017,P=0.427)几个参数并没有表现出实质性差异,云南松幼苗生长在不同磷源处理间的差异不明显;(2)不同磷源处理下云南松幼苗根冠比的大小顺序依次为普通磷源KH2PO4>钙磷Ca3(PO4)2>铝磷AlPO4>无磷CK>铁磷FePO4 · 4H2O,幼苗体内磷含量的高低顺序依次为普通磷源KH2PO4>铁磷FePO4 · 4H2O>铝磷AlPO4>钙磷Ca3(PO4)2>无磷CK;(3)普通磷源比其它磷源更能够被云南松幼苗吸收利用;(4)云南松幼苗地下部分磷含量始终比地上部分磷含量高.     

心脏发育候选基因AHNAKβ的克隆和表达研究

心脏发育过程是一个错综复杂的过程,由一系列的基因参与完成.虽然目前已经鉴定出很多与心脏发育相关的基因,但是仍有很多心脏发育相关基因有待鉴定.作者从小鼠心脏cDNA文库中分离并鉴定了一个心脏发育候选基因AHNAKβ.AHNAKβ位于11q12.2,长1 064 bp,由6个外显子和5个内含子组成,其中开放阅读框(ORF)长450 bp (258~710 nt),编码含有149个氨基酸,蛋白质大小约为16.0 kD.我们构建了原核细胞表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化了GST- AHNAKβ融合蛋白,然后制备了该蛋白的兔免疫血清.利用该抗体进行了小鼠成体组织Western blot以分析该基因的蛋白表达模式.研究结果表明AHNAKβ在小鼠成体子宫、小肠等多种组织表达,在心脏中表达较高,提示它可能在心脏组织中具有某种重要作用.     

果蝇odd蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备研究

odd是一个新发现的心脏特异表达基因。为了进一步研究odd在心脏发育中的功能,根据已报道的odd基因序列,以果蝇cDNA文库为模板进行PCR扩增,将所得的odd部分编码区序列连接到pET-28a载体上构建原核表达载体;重组子经酶切测序鉴定后,转化到大肠杆菌BL21菌株,IPTG诱导融合蛋白表达,Ni-IDA凝胶柱亲和纯化,纯化后的His-odd融合蛋白免疫新西兰大白兔以制备多克隆抗体,Western Blot检测抗体活性。结果表明,获得了odd原核表达重组融合蛋白以及高效价的、特异性兔抗Odd多克隆抗体,为后续的odd功能研究奠定了基础。