利用合成的基因回路实现细胞水平上尿酸稳态控制的实验研究

目的:利用合成生物学方法构建尿酸介导的基因回路,在细胞水平上研究回路对尿酸稳态的调控作用。方法:以耐辐射异常球菌R1基因组中转录抑制物基因hucR及其结合位点基因hucO为基础,化学合成具有转录抑制功能的基因mUTs及其结合位点的8串联结构hucO8,构建基因回路;转染HeLa细胞,通过检测分泌型碱性磷酸酶(SEAP)的表达量来验证回路的作用原理和对尿酸的感应作用;在此基础上,用优化的黄曲霉菌尿酸氧化酶(Uox)基因smUox替换SEAP基因,转染HeLa细胞,通过检测转染前后培养基中尿酸浓度的变化,验证回路对尿酸的调节作用。结果:分别构建了优化的转录抑制物表达载体pcDNA3.1/V5-mUTs、报告基因表达载体pSEAP-hucO8、优化的黄曲霉菌Uox表达载体phucO8-smUox、pBudCE4.1-smUox,双向共表达载体pBudCE4.1-SEAP-mUTs、pBudCE4.1-mUTs-smUox;单独转染pBudCE4.1-SEAP-mUTs或共转染pSEAP-hucO8和pcDNA3.1/V5-mUTs,通过检测培养基中SEAP的表达量,证明双载体及单载体回路对尿酸的感应作用;用smUox替换SAEP基因后,通过检测转染48 h后培养基中尿酸含量的变化,证明双载体及单载体基因回路均具有一定的尿酸调节能力。结论:在细胞水平上,构建的双载体基因回路(phucO8-smUox、pcDNA3.1/V5-mUTs)和单载体基因回路(pBudCE4.1-mUTs-smUox)均可实现对尿酸的感应及调控作用,在一定范围内通过增加mUTs与hucO8的摩尔比,可以改变回路对尿酸的调控范围及调节程度。     

遗传性红细胞增多症相关HIF2α基因点突变对人CD34+造血干祖细胞体外红系分化的影响

该文旨在研究与遗传性红细胞增多症相关的低氧诱导因子HIF2α基因点突变对人造血干祖细胞红系分化的影响。通过构建人HIF2α基因编码区、携带疾病相关的两个点突变体(M535V和G537R)以及文献中报道的HIF2α基因阳性对照突变(P531A)慢病毒表达载体,分别包装病毒并感染人脐血来源的CD34+造血干祖细胞,并进行常氧及5%低氧条件下的红系定向诱导分化培养。利用FACS流式分析比较红系分化进程特征分子CD71和CD235a的表达变化,结合荧光定量PCR检测HIF2α调控的红系分化相关的靶基因表达水平。结果显示,构建的HIF2α及突变体的慢病毒载体经病毒包装后感染K562细胞可在RNA和蛋白水平实现过表达;与对照组相比,感染表达HIF2α基因或其突变体病毒后的脐血CD34+HSPC在常氧及5%O_2条件下诱导红系分化培养的细胞CD71和CD235a的表达动态均无明显改变,但HIF调控的红系分化相关基因EPOR和VEGFA的表达水平有一定升高。综上,在体外红系分化培养体系中,慢病毒介导的HIF2α及突变体的过表达不直接影响造血干祖细胞的红系分化进程,提示疾病相关的HIF2α基因突变造成的红系分化异常增多的细胞内外调控机制需要更进一步的深入研究。     

菌蜕搭载的埃博霉素促进Caspase-3介导的HeLa细胞凋亡

[目的]初步探讨菌蜕搭载的埃博霉素抑制HeLa细胞增殖的机制。[方法]用半抑制浓度的游离或菌蜕搭载的埃博霉素B分别处理HeLa细胞4~48 h,应用凋亡检测试剂盒分析细胞凋亡情况,应用Caspase-3分析试剂盒检测Caspase-3的活性,并用透射电镜观察细胞的形态变化。[结果]菌蜕搭载的埃博霉素B能更快地诱导HeLa细胞发生时间依赖的凋亡和坏死,处理24 h时早期凋亡细胞及晚期凋亡和坏死细胞的比例分别达32.72%和18.36%,处理48 h时比例分别达23.14%和51.52%。该药物还能诱导更强的Caspase-3激活,处理24 h时其活性约为游离埃博霉素B的1.5倍。Caspase-3活性的升高程度与细胞的早期凋亡程度相平行。该药物处理的HeLa细胞显示典型的凋亡特征。[结论]菌蜕搭载的埃博霉素B能更有效地促进Caspase-3介导的HeLa细胞凋亡。     

一种改良的大豆线粒体DNA提取方法

以大豆(Glycine max (L.) Merrill)黄化苗为材料,通过优化提取线粒体DNA(mtDNA)时差速离心过程中的离心力和离心时间,以及纯化过程中设置不同的蔗糖密度梯度和裂解液浓度,结合高盐法去除蛋白质,改良大豆mtDNA的提取方法。结果表明,该方法提取的mtDNA浓度和纯度较高,无叶绿体和核基因组DNA的污染,可用于后续大豆线粒体基因组的相关研究。     

SRO9基因参与调控酿酒酵母内质网应激反应

【目的】研究酵母SRO9基因在内质网应激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)中的作用。【方法】利用PCR介导的同源重组方法构建SRO9基因缺失菌株,检测其在内质网应激诱导剂衣霉素处理条件下的克隆形成能力;通过比色法检测细胞内的H2O2含量,超氧化物歧化酶SOD活性和细胞增殖能力;通过实时荧光定量PCR检测内质网应激靶基因和超氧化物歧化酶编码基因SOD1及SOD2的转录水平。【结果】相对于野生型酵母菌株,SRO9基因缺失酵母菌株对内质网应激诱导剂衣霉素的抗性增强,参与内质网应激反应的靶基因转录上调;细胞内H2O2含量下降,SOD1、SOD2转录水平降低,总SOD活性降低;对氧化剂CHP和VK3的抵抗性减弱,复制寿命明显缩短。【结论】SRO9基因缺失酵母细胞对内质网应激诱导剂衣霉素的抗性增强,原因可能是由于SRO9基因缺失激活了细胞的内质网应激反应。     

中国新记录穗芽水葱的分类学研究

该文报道了发现于浙江省景宁畲族自治县山地沼泽中的莎草科水葱属一中国新记录种———穗芽水葱(Schoenoplectus gemmifer C. Sato, T. Maeda ＆ Uchino)。该种外形与水毛花相似,但其秆质地较柔软,小穗较短,花柱2,具无性繁殖的穗芽。染色体数目为2n ＝78±2(水毛花的染色体数目为2n ＝44)。文献记载穗芽水葱特产于日本,并被列为日本稀有物种。该种在景宁的发现,对研究中国—日本植物区系具有重要学术价值。     

核质双向转运受体Importin13 在翼状胬肉中的表达及意义

目的:探讨核质双向转运蛋白Importin13(IPO13)在翼状胬肉中的表达及意义。方法:收集2015年1月至2015年6月在中南大学湘雅医院眼科门诊确诊为"翼状胬肉"并行手术切除患者标本5例作为翼状胬肉组,收集人正常球结膜组织5例作为人正常结膜组织组,采用免疫组织化学方法检测两组结膜上皮和翼状胬肉组织IPO13、核转录因子p63、ABCG2、CD133的表达。结果:IPO13及p63表达定位于结膜上皮和翼状胬肉组织上皮基底细胞核内,ABCG2表达定位于结膜上皮和翼状胬肉上皮基底细胞层细胞浆及细胞膜,CD133表达定位于结膜上皮和翼状胬肉上皮基底细胞层细胞膜。IPO13、p63、ABCG2及CD133在人正常结膜组织中均呈低表达(光密度OD值IPO13:0.43±0.30;p63:139.09±40.15;ABCG2:63.63±22.56;CD133:70.31±33.41);在翼状胬肉中表达均明显增高(OD值IPO13:155.1±21.80;p63:617.35±87.43;ABCG2:214.03±34;CD133:201.05±46.38)。两组之间差异显著(IPO13:t'=15.87,P0.005;p63:t'=11.92,P0.005;ABCG2:t=8.15,P0.005;CD133:t=5.08,P0.005)。结论:IPO13、p63、ABCG2及CD133在翼状胬肉中高表达提示其可能在翼状胬肉异常增殖性病变中起着正向调控作用。     

周脂素在糖尿病肾病大鼠肾组织中的表达

目的观察大鼠糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)模型的特点和尿LN对早期DN的诊断价值,探讨周脂素(perilipin,Plin)在DN大鼠肾脏中的表达情况。方法将14只SD雄性大鼠随机分为对照组(普通饲料)和糖尿病肾病模型组(高糖高脂饲料),对照组6只,模型组8只,饲养4周后模型组按照30mg/kg剂量注射1%链脲佐菌素(STZ),检测血糖≥16.7mmol/L,糖尿病模型制作成功,继续喂养6周,检测24h尿蛋白≥30mg/kg,糖尿病肾病模型制作成功。考马斯亮蓝检测24h尿蛋白、ELISA测尿层粘连蛋白,HE染色观察肾组织的病理变化,Real-time PCR及Western blot检测肾脏组织中perilipin表达情况。结果模型鼠24h尿蛋白≥30mg/kg,糖尿病肾病大鼠模型制作成功。和对照组大鼠相比,模型组的肾重/体重比明显增高(P<0.05),尿量、尿层粘连蛋白于5周出现升高、24h尿蛋白于6周时出现升高,且三项指标均随着时间不断增高。肾组织病理检查显示:肾小球肥大,基膜增生,微小血管瘤形成,肾小管管腔变形,上皮脱落、空泡样变,大量单核、淋巴等炎性细胞浸润,间质内胶原纤维增生。模型组大鼠肾组织Plin的mRNA及蛋白表达均明显的升高(P<0.05)。结论尿层粘连蛋白比24h尿蛋白升高得早,可作为早期糖尿病肾病的警示指标。Plin表达增高可能参与了糖尿病肾病肾病变过程,为进一步探讨糖尿病肾病的发病机制提供新的思路。     

白菜型油菜品种萌发期的抗旱性鉴定与筛选

秋旱影响我国长江流域油菜的播种和生长。从遗传基础广泛的白菜型油菜资源中筛选抗旱材料,对于培育抗旱油菜品种具有重要意义。以不同浓度的PEG-6000溶液于萌发期对5份不同遗传背景的白菜型油菜进行模拟干旱胁迫处理,并测定种子萌发抗旱指数、相对发芽率、相对发芽势、相对根长、相对芽长。与对照相比,干旱胁迫下各指标均有显著差异,对各指标进行主成分分析,确定了抗旱性鉴定参数,并确立了白菜型油菜资源抗旱性筛选的工作液为200 g/L的PEG-6000。选用该工作液于萌芽期对203份白菜型油菜资源进行了抗旱筛选,结果表明,模拟干旱胁迫下,大部分材料的抗旱性与对照有显著差异,用隶属函数法和聚类分析对抗旱性鉴定指标进行分析,并对所有供试材料的抗旱性进行了排序,鉴定出了抗旱性最强的PI226505白菜型油菜,其来源为Iran,为油菜下一步抗旱性遗传改良奠定了基础。     

食管癌患者在放射治疗中不同营养途径的护理管理效应

目的:探讨不同营养途径包括直接经食管与间接经鼻饲、胃造瘘进食的食管癌患者在放射治疗过程中的护理措施和方法对患者的临床效应。方法:回顾性分析我科一年来放射治疗的63例食管鳞状细胞癌患者的临床资料,其中46例患者直接经食管进食,其余17例治疗前行鼻饲或胃造瘘进食,在治疗过程中注重对患者的心理护理、饮食及放疗并发症护理。结果:放疗前行鼻饲或食管造瘘患者在放疗过程中依从性好,放射性食管炎能更好的控制,未发生食管穿孔及食管气管瘘等重大放疗并发症。结论:放疗前行鼻饲或胃造瘘的食管癌患者,周密的观察与细致的护理,主动的护患沟通,会导致积极的临床效应,可减轻放射损伤,降低食管穿孔及食管气管瘘的几率,延长患者生命,提高其生活质量。