果糖基转移酶及其固定化研究进展

果糖基转移酶能够催化蔗糖水解并通过转果糖基作用产生低聚果糖。本文综述了十几年来国内外对果糖基转移酶及其固定化研究的若干结果和进展。对该领域的发展趋势作了扼要的展望。     

提取酶法测定FDP

本文建立了提取酶法测定１,６－二磷酸果糖的方法,该法检测发酵生产过程中所生成的１,６－二磷酸果糖的含量准确度高,检测迅速、可靠。     

球形芽胞杆菌C3-41磷酸果糖激酶的克隆、表达及基本生物活性

[目的]球形芽孢杆菌缺乏EMP、HMP、ED途径的关键酶,如磷酸果糖激酶等被认为是其不能以糖类物质进行生长的主要原因.杀蚊球形芽孢杆菌C3-41全基因组序列分析表明,在染色体DNA上存在的磷酸果糖激酶基因pfk,为了进一步分析球形芽孢杆菌糖酵解途径,进一步确定磷酸果糖激酶在糖酵解途径中的功能.[方法]通过pfk基因在球形芽孢杆菌菌株中的Southern-blot拷贝数鉴定,在C3-41pfk基因克隆的基础上进行pfk基因在大肠杆菌中的融合表达、序列分析和序列比对等方法进行研究.[结果]证明了球形芽孢杆菌pfk基因由960 bp核苷酸组成,表达42 kDa的PFK融合蛋白,有保守的底物结合域和ATP结合域,同时pfk基因重组表达质粒可以回复大肠杆菌pfk缺陷型菌株DFl020代谢糖的能力.[结论]杀蚊球形芽孢杆菌C3-41的pfk表达产物具有磷酸果糖激酶活性,为今后深入研究球形芽孢杆菌产能代谢机理奠定了基础.     

The Presence and Localization of Thioredoxins in Diatoms,Unicellular Algae of Secondary Endosymbiotic Origin

Diatoms are unicellular algae of great ecological importance. So far, very little is known about the regulation of carbon fixation in these algae; however, there are strong indications that in diatom plastids, the ferredoxin/thioredoxin system might play a minor role in redox regulation of the photosynthetic reactions compared to land plants. Until now, it is unknown whether there are fewer or other target enzymes of thioredoxins in diatoms. Only a single potential target enzyme for thioredoxin, the plastidic fructose-l,6-bisphosphatase, has yet been identified. Nevertheless, during the annotation of the genome of the diatom Phaeodactylum tricornutum, we identified several genes encoding different thioredoxins. Utilizing in vivo expression of GFP：presequence fusion proteins in P. tricornutum, we were able to show that these thioredoxins are targeted either into plastids, mitochondria, or remain in the cytosol. Surprisingly, two of the three usually cytosolic thioredoxin h proteins are apparently plastid associated and, together with a thioredoxin reductase, putatively located in the periplastidic compartment. This is one of the few indications for so far unknown enzymatic reactions in the space between the two pairs of diatom plastid envelope membranes.     

刚地弓形虫RH株果糖1，6-二磷酸醛缩酶的基因序列分析与融合表达

目的：对编码刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）RH株果糖1,6-二磷酸醛缩酶基因进行克隆和序列分析,并构建原核栽体pETcFN融合表达该重组蛋白,以研究该分子在弓形虫速殖子入侵中的作用。方法：从刚地弓形虫RH株速殖子cDNA中扩增编码果糖1,6-二磷酸醛缩酶的基因,并克隆到T载体上,测序确认;通过PCGENE及在线工具对此编码序列进行分析;将该基因亚克隆到表达栽体pET30a（＋）上,构建质粒pETcFN;表达产物用Western blot进行进一步确认。结果：经PCR鉴定和质粒双酶切鉴定后测序,确认插入T栽体的序列为所需的目的序列。根据序列分析,推断蛋白的预计分子量为39．2kDa,等电点为7．75;BLAST分析,发现同源性52％以上的序列32条;模序分析发现其分别在223～233、21～147及15～363位置隐含有与PS00158（PmfileScan）、PD001128（BlastProDom）及PF00274（HMMPfam）相似的模序,这些序列分子功能均为果糖二磷酸醛缩酶活性。该编码片段亚克隆到栽体上成功构建融合表达质粒pETcFN,转化到大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达,得到分子量为43kDa的融合蛋白。Western blot的结果与预测相符。     

天山雪莲sikFBA1基因克隆定位及表达分析

果糖-1,6-二磷酸醛缩酶FBA家族(fructose-l,6-bisphosphate aldolase)在植物响应逆境调控中具有重要的意义。该研究基于天山雪莲低温转录组研究,采用RT-PCR方法克隆了1个sikFBA1基因,ORF长度为1 077bp,共编码358个氨基酸,含有1个保守的Glycolytic结构域,具有典型的FBA家族特征。系统进化分析发现,sikFBA1蛋白分类上属于Ⅰ型FBA,与来自四叶参(Codonopsis lanceolata)的同源蛋白亲缘关系最近。亚细胞定位结果表明,sikFBA1蛋白定位于细胞质,属于胞质型同工酶,与预测一致。实时定量PCR结果显示,天山雪莲经过不同低温(4℃/-2℃)处理,sikFBA1基因的表达水平整体下调,但该基因在冷胁迫与冰冻胁迫、冷驯化与非冷驯化下呈现出不同的表达模式。研究表明,sikFBA1基因参与了天山雪莲低温胁迫的响应。     

低聚果糖对慢性应激小鼠抑郁样行为及 肠道菌群的影响

目的探讨低聚果糖(FOS)对慢性应激小鼠的抑郁样行为及肠道菌群的影响。方法选取8周龄健康雄性ICR小鼠随机分成3组,C组小鼠每天给予正常护理,S组和SF组小鼠每天随机给予1～2种应激源,持续8周,SF组小鼠在应激造模的同时经食物补充FOS。在造模4周和8周后,分别通过强迫游泳、蔗糖偏好试验评估各组小鼠抑郁样行为。造模结束后通过Western blot试验检测小鼠大脑皮层内糖皮质激素受体(GR)的表达,并收集结肠内容物进行16SrDNA扩增子测序分析。结果应激造模8周后,C、S和SF三组小鼠的肠道菌群组成存在明显差异;与C组相比,S组小鼠强迫游泳的不动时间显著增加(t=3.970,P=0.0009),蔗糖偏好率显著降低(t=3.890,P=0.0011),脑内GR的表达显著降低(t=4.311,P=0.0125);与S组相比,SF组小鼠强迫游泳的不动时间显著缩短(t=3.495,P=0.0026),蔗糖偏好率和脑内GR表达有增加趋势。结论益生元FOS可调节肠道菌群,改善慢性应激诱发的精神情绪异常。     

枸杞果糖激酶基因LbFRK7的克隆及表达分析

该研究以‘宁杞1号’枸杞果实为材料,基于转录组测序TR28373|c0_g1序列,利用RT-PCR技术,克隆出枸杞果糖激酶基因LbFRK7的全长序列为1 060bp,其中,ORF开放阅读框为1 044bp,编码有348个氨基酸,蛋白质分子量为37.44kD,理论等电点5.05;LbFRK7编码的氨基酸序列包含有pfkB碳水化合物激酶家族高度保守的3个特异性区域,2个底物识别位点,4个ATP结合位点;LbFRK7与烟草和辣椒的FRP7基因序列相似性较高,达到90%;利用实时荧光定量技术分析发现,不同组织中LbFRK7基因均有表达,且果实中的表达量最高,根中最低;随着果实的发育,果实中LbFRK7基因的表达量呈先升后降的变化趋势,并于开花后15d达到最高。在果实发育前期,LbFRK7基因的表达量与果糖含量的变化趋势相同,但在果实发育中期和后期,LbFRK7基因的表达量与果糖含量的变化趋势相反。相关分析结果显示,LbFRK7表达量与果糖和蔗糖含量的相关系数分别为-0.326和-0.339,但均未达到显著水平。研究表明,LbFRK7基因在枸杞果实发育过程中对果糖转化起到一定作用,特别是在果实成熟过程中对果糖含量的升高具有重要的作用。该研究结果为进一步探讨枸杞LbFRK7的功能及果糖代谢奠定了基础。     

丝状真菌转化葡萄糖为果糖一1,6一二磷酸的研究

80至90年代发现果糖-1,6-二磷酸(Fructose-1,6-diphosphate FDP)在医药、保健品和植物生长调节方面的诸多用途,尤其用于医药备受关注.传统FDP的生产是用面包酵母或啤酒酵母作酶源,通过糖酵解过程而获得(Leisola et al.,1974),以后有用固定化酵母细胞、固相化多酶系统及嗜热脂肪芽胞杆菌转化葡萄糖为FDP的专利报道,还有采用重组啤酒酵母转化乳糖为FDP(Compagno et al.,1993)及用CTAB代替甲苯改变酵母细胞透性,以葡萄糖为碳源生物合成FDP(于明安等,1995)的研究等.本文首次报道用丝状真菌毛霉mucor sp.高效转化葡萄糖为FDP的研究结果.     

微生物菊粉酶基因结构、酶学性质与应用研究进展

综述了微生物菊粉酶基因结构、酶学性质、发酵生产与应用等方面研究的最新进展。