环糊精葡萄糖基转移酶的酿酒酵母表面展示及其生产2-O-α-D-吡喃葡萄糖基抗坏血酸

摘要:【目的】将环状芽孢杆菌251(Bacillus circulans 251)来源的环糊精葡萄糖基转移酶(Cyclodextrin Glycosyltransferase,CGTase)展示在酿酒酵母( Saccharomyces cerevisiae)细胞表面,构建全细胞催化剂生产2-O-α-D-吡喃葡萄糖基抗坏血酸(2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic acid,AA-2G),以提高AA-2G 的产量。【方法】将CGTase编码基因cgt连接到载体质粒pYD1中的a凝集素(a-agglutinin)Aga2p亚基基因的下游构建表面展示重组质粒pYD1-cgt,转化酿酒酵母EBY100获得重组菌EBY100-pYD1-cgt,对发酵条件(培养基、诱导温度和诱导剂半乳糖浓度)进行优化;同时先后对重组菌的发酵产酶以及表面展示CGTase的酶促合成AA-2G的条件进行了优化;进一步又比较了表面展示的CGTase与E.coli BL21发酵所得的游离CGTase在酶促制备AA-2G过程中副产物的积累情况。【结果】展示CGTase的酿酒酵母重组菌株以YPG培养基作为发酵培养基,诱导剂半乳糖初始添加浓度为20 g/L,经25 ℃诱导48 h后,表面展示CGTase最大酶产量为0.5 U/mL;表面展示CGTase 40 ℃条件下的温度稳定性比游离酶有所提高,pH稳定范围变宽。对表面展示的CGTase制备AA-2G转化条件的优化发现,其最适温度最适pH分别为30 ℃和4.5,转化48 h达到平衡,表面展示的CGTase制备AA-2G的产量较游离酶提高了37%。【结论】对于CGTase,a凝集素系统是一个有效的展示系统,构建的酿酒酵母全细胞催化剂用于酶促制备AA-2G时,产生的副产物葡萄糖可能被酵母细胞利用,从而降低了葡萄糖与VC的竞争作用使AA-2G的产量增加,该全细胞催化剂具有良好的应用前景。     

化学添加剂提高重组α-环糊精葡萄糖基转移酶酶制剂稳定性

通过向重组α-环糊精葡萄糖基转移酶 (α-CGT酶) 液中添加化学添加剂以提高其热稳定性及贮存稳定性。在不同温度下研究了添加剂对酶液的贮存稳定性影响,并用圆二色谱 (CD) 研究了CGT酶在近紫外区和远紫外区蛋白质结构与热稳定性的变化关系。当单独加入各种添加剂在50 ℃水浴1 h和室温放置108 d后,发现含有20％甘油的酶液稳定性最好,与未加任何添加剂的对照酶液相比仍有91％和50％的酶活,对照酶液在50 ℃水浴1 h后仅有小于10％的活性,室温放置108 d后已经没有酶活。明胶、CaCl2和PEG40     

重组大肠杆菌生产L-色氨酸发酵条件优化

为了提高重组大肠杆菌FB讲／pSV－04发酵生产L－色氨酸的产量,减少代谢副产物乙酸的生成,考察了比生长速率和无机盐对重组大肠杆菌发酵生产L．色氨酸的影响。在确定了合适的比生长速率和无机盐浓度之后,乙酸积累很少,L-色氨酸的产量为53．4g／L,比优化前提高了141．6％。经30L发酵罐初步放大,L－色氨酸的产量达53．6g／L,发酵结果稳定,具有工业化应用前景。     

重组β-环糊精葡萄糖基转移酶生产β-环糊精的工艺条件优化

将来自于Bacillus circulans 251的β-CGTase编码基因克隆到表达载体pET-20b(+),转化Escherichia coli BL21(DE3)。经酶活检测培养基上清中的β-CGTase酶活为20 U/mL。对酶转化淀粉生成β-环糊精的反应条件进行了优化,结果表明,当底物马铃薯淀粉浓度15%,反应初始pH5.5,温度30℃,加酶量10 U/g干淀粉,环己烷浓度2.5%-5%(V/V),转化周期24 h,β-环糊精转化率达到最高值75.3%,是国内外报道的酶法生产β-环糊精的最高水平。     

多酶复配合成海藻糖及其分离提取的研究

以大米淀粉为原料,多酶复配制备海藻糖。确定了实验室条件下多酶复配生产海藻糖的最佳条件:以15%(m/V)大米淀粉为底物,催化温度45℃、pH 6. 0、DE值16、α/β-CGTase加量为1. 4U/ml、催化28h后糖化处理12h,海藻糖转化率由双酶法催化的50%提高至73%。在底物浓度为25%(m/V)时,海藻糖产量最高达到182. 5g/L,随后对高浓度海藻糖进行分离提取,分别考察了活性炭脱色、离交分离、浓缩结晶等对海藻糖提取效率的响。     

多功能过氧化物酶介导Mn(III)络合体系对酚类化合物的氧化降解

【背景】酚类化合物是环境中主要的水体污染物之一。多功能过氧化物酶(versatile peroxidase,VP)介导的Mn (III)-有机酸络合体系具有较高的氧化还原电势,在酚类有机污染物降解方面具有巨大潜力。【目的】探究VP介导的Mn (III)-有机酸络合体系降解酚类化合物的能力,为酚类化合物的降解提供新的思路和方法。【方法】研究选取了糙皮侧耳(Pleurotus eryngii)来源的多功能过氧化物酶(PeVP),采用包涵体复性的方法获得了PeVP活性蛋白,并对重组PeVP进行酶学性质研究及Mn (III)络合体系反应条件优化,进而探究Mn (III)络合体系对酚类污染物的氧化降解能力。【结果】确定了PeVP包涵体复性最佳条件为：pH 9.5、10%甘油、0.5 mol/L尿素、0.5 mmol/L氧化型谷胱甘肽(glutathione oxidized,GSSG)、0.1 mmol/L二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT)、0.1 mmol/L乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraacetic acid,EDTA)、5 mmol/L CaCl₂、5µmol/L羟高铁血红素(hematin),4℃静置透析24 h,最后5µmol/L hematin孵育12 h。通过对PeVP介导的Mn (III)-有机酸络合体系优化,确定了最优反应条件为：75 mmol/L苹果酸缓冲液(pH 4.5)、6 mmol/L Mn²⁺和0.2 mmol/L H₂O₂。在上述条件下,探究了络合体系对2,2-丁香醛连氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2,2ʹ-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate),ABTS]、2,6-二甲氧基苯酚(2,6-dimethoxyphenol,DMP)、愈创木酚和丁香醛连氮4种酚类模式底物的催化活性,发现在pH 4.5条件下,络合体系对酚类模式底物的氧化活性可达到PeVP直接氧化活性的1.5−7.5倍,并且在16 h的酶解过程中,苯酚、对苯二酚、间苯二酚和对硝基苯酚的平均降解速率分别为10.91、10.69、6.50和5.71 mg/(L·h),推测Mn (III)-有机酸络合物对酚类底物的氧化降解是通过夺取酚类底物的电子形成酚类自由基中间体,自由基中间体经过电子重排和C−C键的断裂,最终导致酚类物质的氧化降解。【结论】在弱酸(pH 4.5)条件下PeVP介导的Mn (III)-苹果酸络合体系对酚类污染物具备较强的氧化能力,这为酚类有机污染物提供了新的生物解决方案。     

利用游离型表达质粒强化毕赤酵母表达木聚糖酶

巴斯德毕赤酵母是用途广泛的蛋白表达系统。目前用于毕赤酵母的质粒主要以整合型质粒为主,很少见到游离的质粒用于外源基因的表达。文中通过将来源于酵母自身的自主复制序列连接到酵母整合型表达载体pGAP中构成自主复制的游离型表达载体pGAPZαA-PARS,将该载体用于表达木聚糖酶基因。转化毕赤酵母后同传统的整合型表达菌株相比,以甘油为碳源时最高酶活达到343 U/mL,比整合型表达提高了45.9%。同时游离载体表达重组酶比活相对整合表达提高了81.2%。为了节约发酵成本,进一步研究了分别以甘油、葡萄糖、蔗糖、混合碳源(蔗糖︰甘油=1︰2)等不同碳源下游离型重组菌株的表达水平。发现甘油表达水平最高,蔗糖最低,但是以工业葡萄糖为碳源时产酶成本最低。由于pGAP载体不需要以甲醇为碳源,因而文中所构建的游离载体pGAPZαA-PARS极大促进了毕赤酵母在食品行业中的应用。同时,游离型载体可大幅度提高表达水平,为进一步研究提高GAP启动子的高效表达奠定了基础。     

基于体外分子进化技术提高弯曲芽孢杆菌CCTCC 2015368 β-淀粉酶的热稳定性

运用体外分子进化技术易错PCR方法,高通量筛选热稳定性提高的弯曲芽孢杆菌Bacillus flexus CCTCC2015368β-淀粉酶突变体。利用LB琼脂淀粉板显色、96-孔板DNS法测酶活和酶标仪检测等,最终筛选到了一株热稳定性显著提高的突变体D476N。野生型和突变体D476N分别纯化后,酶学性质测定表明:突变体D476N的最适pH为6.5,与野生型相比降低了0.5。突变体D476N和野生型的最适温度均为55℃,突变体D476N在55℃下的半衰期为35 min,比野生型提高了95%。突变体D476N的T_(50)值比野生型提高4℃。突变体D476N的K_m值为97.98μmol/L,是野生型(85.86μmol/L)1.14倍;突变体稳定性提高的同时,催化活力相对于野生型有略微下降。通过SWISS-MODEL同源模拟野生型和突变体D476N的三维结构,并通过PyMol软件分析,发现突变后的氨基酸残基Asn476位于蛋白质表面的loop环上,通过MOE软件计算,D476N的分子自由能(ΔG)为106.01kcal/mol,比野生酶降低10.3%,这一结果与蛋白质分子自由能和热稳定性呈负相关的理论相符。