利用重组大肠杆菌生产α-环糊精葡萄糖基转移酶

将来源于软化类芽孢杆菌（Paenibacillus macerans）的α-环糊精葡萄糖基转移酶（α-CGT）基因插入含pelB信号肽的质粒pET-20b（＋）中,构建了表达载体pET-20b（＋）／cgt,并将其转化表达宿主E.coli BL21（DE3）。对重组菌E．coli BL21／pET-cgt进行摇瓶发酵条件的优化,确定了其胞外表达α-CGT酶的最适条件：葡萄糖8g/L,乳糖0．5g/L,蛋白胨12g/L,酵母膏24g/L,K2HPO472mmol／L,KH2PO417mmol／L,CaCl2 2．5mmol／L;初始pH为7．0,诱导温度为25℃。在该条件下培养90h后最终α-CGT酶的胞外比活达到22．1u／mL,与来源菌Pmacerans所产天然酶比活相比提高了42倍,实现了α-CGT酶的高效生产。将基因工程菌在上述条件下于3L发酵罐中发酵,90h后胞外酶比活达到22．6U／mL,证实了工业化放大的可能性。     

木毒蛾的研究

木毒蛾(Lymantria xylina Swinhoe)是木麻黄的重要害虫,1971年以来,连续在福建沿海的木麻黄防护林内大面积发生。该虫一年一代,以滞育幼虫在卵壳内越冬。翌年3月中旬孵化。幼虫一般7龄,幼虫期45—64天。在木麻黄枝条或树干上化蛹,化蛹盛期为5月下旬,蛹期5—14天。羽化盛期为6月上旬。卵产在木麻黄枝条或树干上。已知的被害植物有21科39种。嗜食普通木麻黄。主要天敌是核多角体病毒和卵跳小蜂。 可采用人工采卵、喷洒化学农药、施放白僵菌粉炮或喷洒多角体病毒悬液进行防治。     

黑胸散白蚁对不同材料及3种处理方法偏好性的研究

为了寻找对黑胸散白蚁具有高诱食性的物质及处理方法对其取食偏好性的影响,本研究共选取了9种材料,通过测定其嗅觉反应,筛选出选择系数0.1的玉米杆、杨木和雪松;然后,对这3种材料分别进行了蒸煮、自然腐朽和人工接菌处理,测定其嗅觉反应并进行选择性取食量验证。结果表明,蒸煮处理可提高玉米杆和杨木对黑胸散白蚁的引诱力,但对雪松无此作用,并且蒸煮处理对选择性取食量无显著影响;腐朽处理可提高玉米杆、杨木和雪松的引诱力,但仅对玉米杆和杨木的选择性取食量存在显著影响;人工接种3种木腐菌,均可提高玉米杆对黑胸散白蚁的引诱力,且能够显著提高散白蚁对密粘褶菌玉米杆粉培养物和杨木粉培养物的选择性取食量。结果表明,玉米杆和杨木对黑胸散白蚁具有较好的引诱性,且经过腐朽处理或人工接种密粘褶菌后,可明显改善其诱食效果。因此,在研制针对黑胸散白蚁的毒饵技术时,可采用这两种诱食材料作为基饵。     

亚位点?7处突变对碱性芽胞杆菌CGT酶产物特异性的影响

为了研究来源于碱性芽胞杆菌的γ-环糊精葡萄糖基转移酶(CGT酶)具有较高产物特异性的作用机理,对其氨基酸序列和模拟结构进行了分析,确定其亚位点7处氨基酸的缺失可能影响其产物特异性。运用重叠PCR的方法,在其亚位点7处添加缺失的6个氨基酸,造成插入突变。将突变基因与pET-20b(+)连接并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。以可溶性淀粉为底物进行酶转化,HPLC分析转化产物中的环糊精含量。结果表明,相对于野生型γ-CGT酶,突变酶转化生成的3种环糊精中,γ-环糊精所占的比例从76.0%降至12.5%,α-、β-环糊精分别从8.7%和15.2%提高至37.5%和50%。分析其可能机理为:与α-、β-CGT酶相比,野生型γ-CGT酶的亚位点7处缺失6个氨基酸,该构象为葡萄糖的结合提供了更大的空间,从而更适合γ-环糊精的生成;而在其亚位点7处插入6个氨基酸,造成插入突变后,葡萄糖链结合的空间变小,这种构象不利于γ-环糊精的生成。     

大肠杆菌高效表达重组蛋白策略

大肠杆菌表达系统是基因表达技术中发展最早和目前应用最广的经典表达系统。利用该系统表达重组蛋白具有许多优越性,但其表达效率受诸多因素的影响。本文综述国内外利用大肠杆菌表达系统高效表达外源蛋白的策略,主要包括选择合适的启动子、改变信号肽结构、提高mRNA稳定性、提高翻译效率、表达稀有密码子、降低包涵体形成及蛋白降解,利用融合蛋白与分子伴侣、调控发酵条件实现高密度培养等。     

碳水化合物结合模块-嗜热子囊菌角质酶融合蛋白在PET降解中的应用

随着全球经济的发展,聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)塑料的生产量大幅提高,其废弃总量也逐年递增。废弃PET处理方法主要包括填埋、焚烧及生物降解等。填埋和焚烧均会造成二次污染,而生物降解因其环境友好特性逐渐成为研究热点。相关研究表明,碳水化合物结合模块(carbohydrate binding module,CBM)可以有效增强PET降解酶对PET的吸附,从而增加降解速率。通过大引物PCR (megaprimer PCR of whole plasmids,MEGAWHOP)技术,将炭疽杆菌(Bacillus anthraci)来源的CBM与嗜热子囊菌(Thermobifida fusca)角质酶(Tfuc)构建融合蛋白Ba CBM2-Tfuc并表征其PET降解性能。在60℃条件下,Ba CBM2-Tfuc降解PET膜的效率是Tfuc的2.8倍。本研究可为构建高效降解PET的融合蛋白提供技术支持。     

提高源自Bacillus circulans 251的β-CGTase对麦芽糖亲和性及其在生产海藻糖中的应用 *

将B. circulans 251 β-CGTase应用于海藻糖制备,海藻糖转化率从50.4%提高至71.9%。为进一步提高底物的转化率,运用易错PCR-高通量筛选技术筛选对以麦芽糖为歧化反应受体的亲和性提高的B. circulans 251 β-CGTase突变体。利用低底物浓度的96孔板4,6-亚乙基-对硝基苯-α-D-麦芽七糖苷(EPS)显色法,最终筛选得到了一株对麦芽糖亲和性提高的突变体M234I。将野生型β-CGTase和突变体酶M234I进行蛋白质纯化,测定其酶学性质。结果表明,突变体的比活为345.25U/mg,野生型则为357.63U/mg;突变体M234I对麦芽糖的K_m为0.258 2mmol/L,仅为野生型(0.474 9mmol/L)的54.4%,对麦芽糖的亲和性显著提高;突变体的最适温度、最适pH较野生型未发生较大变化。以麦芽糊精(DE值16)为底物,将突变体M234I用于多酶复配体系生产海藻糖,酶反应结果表明海藻糖的转化率最高达74.9%,较野生型β-CGTase提高约3%。     

启动子对枯草芽孢杆菌表达环糊精葡萄糖基转移酶的影响

以质粒pHY300PLK为骨架构建Bacillus stearothermophilus来源的α/β-环糊精葡萄糖基转移酶(α/β-CGTase)在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)表达系统的表达质粒。为了提高α/β-CGTase的表达量,考察了9个单启动子(P_(amyQ), P_(amyQ)', Papr E, Pgsi B, Phpa Ⅱ, Pnpr E, Psrf, Pxyl, Pxyl')对α/β-CGTase表达量的影响,摇瓶发酵表明最优单启动子为P_(amyQ)',α/β-CGTase表达量为6.52 U/mL,其次为Phpa Ⅱ和Pnpr E,分别对应酶活5.80 U/mL和5.73 U/mL。用P_(amyQ)'与P_(amyQ)'、Phpa Ⅱ、Pnpr E两两组合,构建双启动子P_(amyQ)'-P_(amyQ)'、Phpa Ⅱ-P_(amyQ)'、Pnpr E-P_(amyQ)',摇瓶发酵表明最优双启动子为Phpa Ⅱ-P_(amyQ)',α/β-CGTase表达量为11.15 U/mL,是用单启动子PamyQ'表达时的1.7倍。测定Phpa Ⅱ-P_(amyQ)'、P_(amyQ)'-P_(amyQ)'、P_(amyQ)'-P_(amyQ)'、P_(amyQ)'、Pgsi B、Phpa Ⅱ为启动子时,α/β-CGTase m RNA转录水平,结果表明α/β-CGTase表达量随m RNA转录水平的提高而提高。使用含有启动子Phpa Ⅱ-P_(amyQ)'的表达质粒进行3 L罐发酵,培养96 h时,α/β-CGTase酶活达到最高110.4 U/mL。     

嗜热网球菌纤维二糖差向异构酶在枯草芽孢杆菌中的表达及发酵优化

通过化学方法合成嗜热网球菌(Dictyoglomus thermophilum)来源的纤维二糖差向异构酶基因ce,将其引入到载体pBSuL3-ce,构建重组质粒pBSuL3-ce并转化进枯草芽孢杆菌,发酵48h后测定胞内酶活为7. 5U/ml。酶学性质结果表明:该酶的最适pH为8. 5;最适温度为85℃,85℃的半衰期为120min。为降低发酵成本,对发酵培养基进行优化:以35g/L豆粕粉为氮源、5g/L甘油为碳源时,酶活力最高可达12. 3U/ml。依据摇瓶优化的条件在3L发酵罐中扩大培养,胞内酶活达到56U/ml,比摇瓶培养酶活提高了8倍。利用发酵所得酶制备乳果糖,在乳糖浓度为400g/L、反应温度为85℃、初始pH 8. 5、加酶量为20U/ml的条件下,乳果糖转化率可达51%。     

大肠杆菌α-溶血素分泌途径研究进展

随着生物技术的不断发展,大肠杆菌胞外分泌分子机理日渐明晰,大肠杆菌表达系统成为实现规模化制备胞外重组蛋白的途径之一。本文综述了大肠杆菌α-溶血素分泌途径的转运机制及应用前景。