大苞萱草ISSR-PCR反应体系的建立与优化

分别采用正交设计和单因子试验两种方法对影响大苞萱草ISSR-PCR反应体系的4个因素(Taq酶,Mg2+,dNTP,引物)在3个水平上进行优化试验。正交设计选用L9(34)方案,采用直观分析法获得影响因素最佳反应水平。单因子试验分别研究各因素对ISSR-PCR反应的影响情况,找出最佳反应水平。两种方法所得影响因素最佳水平存在差异,通过综合比较与分析,最终建立了大苞萱草ISSR-PCR的最佳反应体系。在20μL的反应体系中:Taq酶1 U,Mg2+1.5 mmol/L,dNTP0.20 mmol/L,引物0.4μmol/L,1×PCR buffer,30 ng模板DNA。在此基础上筛选出10个扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物,并通过梯度PCR试验,确定引物最佳退火温度。     

野生毛木耳ISSR-PCR反应体系的建立与优化

为获得条带清晰,重复性好,多态性高的野生毛木耳ISSR扩增结果,通过单因子试验对ISSR-PCR反应条件进行了优化。确定了ISSR分析的最佳PCR条件:25μL反应体系中模板DNA25ng、dNTPs0.24mmol/L、Taq DNA聚合酶1U、Mg2+0.9mmol/L、引物2μmol/L、10×PCR buffer2.5μL、ddH2O12.6μL。最佳退火温度因不同的引物而定,最佳循环次数为35次。在此基础上初步筛选出25条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物。这一优化体系的建立为进一步利用ISSR标记技术进行野生毛木耳种质鉴定及遗传多样性分析提供了一个适合的程序。     

Molecular and biochemical markers of some Vicia faba L. genotypes in response to storage insect pests infestation

Storage insect pests cause serious losses to all legume crops in both quality and quantity. This study was conducted to study some morphological characters and biochemical components in eight genotypes of faba bean to determine biochemical and molecular markers for resistance and susceptibility to infestation with stored insects. The results showed that chlorophyll content in leaves, phenol, tannin, peroxidase (POD), polyphenol oxidase (PPO), and protein content in leaves and seeds of faba bean plants either significantly or non significantly increased the effect of insect infestation in the resistance genotypes (L.551, L.512, L.153, NA112, and L.1) as compared with the susceptible genotypes (L.16 and T.W). Protein electrophoresis showed a wide variation between genotypes and determined some biochemical markers (sodium dodecyl sulfate poly acrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE). In addition, molecular genetic markers for stored insects' resistance were obtained using inter-simple sequence repeat polymerase chain reaction (ISSR-PCR) analyses.     

蚬壳花椒ISSR-PCR反应体系的建立及优化

通过单因素试验及正交设计方法对影响蚬壳花椒ISSR-PCR扩增的主要因素(模板DNA、Mg2+的浓度、引物、dNTPs,TaqDNA聚合酶的用量以及退火温度)进行优化,以建立蚬壳花椒ISSR-PCR反应的最佳体系。结果表明:最佳反应体系(20μL)为模板DNA 60ng、MgCl2 2.5mmol/L、dNTPs 0.15mmol/L、引物0.6μmol/L、TaqDNA聚合酶2.4U。在此基础上,从100条引物中筛选出18条扩增稳定、多态性好的ISSR引物并经过10份蚬壳花椒种质检验,证明该体系具有扩增条带清晰、稳定、重复性好等优点。该反应体系的建立为蚬壳花椒种质资源分类、遗传多样性分析提供了更客观可靠的方法。     

基于ISSR分子标记的枇杷材料亲缘关系分析

为了判断川早枇杷与其他枇杷材料间的亲缘关系,探讨ISSR分析鉴定枇杷变异的有效性。以川早枇杷等13份枇杷品种(品系)为材料,通过DNA提取、ISSR-PCR反应体系建立、引物筛选及PCR扩增,使用Quantity One软件对扩增条带进行统计分析,计算遗传相似系数,并进行UPGMA聚类分析。结果表明:用14条ISSR引物进行扩增,共获得165条带,条带长度为300～1 500 bp; 日本茂木与川早枇杷的遗传相似系数最高,为0.7920,早钟六号和晚钟与川早枇杷的遗传相似系数分别为0.7717和0.7444,当遗传相似系数为0.7160时,13份枇杷材料可以被分为4类。因此,相对于早钟六号,川早枇杷材料在遗传物质上发生了变异,具备成为枇杷新品种的条件。     

栝楼ISSR-PCR反应体系的建立和优化

用改良SDS法提取栝楼(Trichosanthes kirilowii Maxim)叶片DNA为模板,通过单因素试验研究模板、引物、Taq DNA聚合酶和dNTPs等4因素各7个水平对栝楼ISSR-PCR扩增结果的影响,并通过正交试验对各因子的浓度进行优化,首次建立了栝楼ISSR-PCR分析的最适反应体系:20 μL的反应体系中,1×buffer,模板含量为50 ng,引物的浓度为0.5 μmol/L,Taq DNA聚合酶的用量为0.8 U,dNTPs的浓度为200 μmol/L.随机选取10条引物验证体系稳定性,并对190条ISSR引物初筛,得到条带清晰、多态性好的引物126条.经验证,本实验所建立的栝楼ISSR-PCR反应体系具有稳定可靠、可重复性好、多态性较强等特点,能够较好的应用于栝楼的ISSR分子生物学分析.     

皮下盘菌属种内及种间遗传多样性的ISSR分子标记

对皮下盘菌属（Hypoderma）4种23个菌株进行了ISSR分析。结果表明,被试材料ISSR标记多态性好,8个引物共扩增出131个条带,其中126条（占9618％）具有多态性。经欧氏最短距离中的类平均法聚类,得到各菌株之间的ISSR标记的遗传相似性系数（GS）变异范围为0．30—0．82,23个菌株可聚为6类。通过ISSR分析结果与表型性状的比较和分析,明确了悬钩子皮下盘菌种内遗传差异体现在子囊果大小、形状及埋生深度、唇特征、侧丝顶端形状、子囊和子囊孢子形状及大小,以及寄主、着生部位和分布区域方面;皮下盘菌属的种间差异主要表现在子囊果、唇、侧丝、子囊及分生孢子器等部分形态学特征、寄主及着生部位方面。     

党参基因组DNA提取、ISSR-PCR反应体系优化及引物筛选

对党参基因组DNA提取方法优化、ISSR体系形成及引物筛选三方面进行探讨,为研究党参居群遗传多样性及药材DNA鉴定奠定基础。经比较改良CTAB法、改进的高盐SDS法和试剂盒三种常用DNA提取方法,发现改良CTAB法效果最佳;利用优化设计并结合有关文献优化ISSR反应体系,最优反应体系为：50 μL总反应体积中含约20 ng DNA模板,1.25 U Taq DNA聚合酶,2.25 mmol·L^-1 Mg²⁺,200 μmol·L^-1 dNTP,0.50 μmol·L^-1引物。以此体系为基础进行引物筛选,在100条ISSR引物中筛选出13条扩增条带清晰、多态性较高、重复性好的引物。     

丹参ISSR-PCR反应体系的建立与正交优化

利用正交试验设计的方法,从引物浓度、Taq DNA聚合酶浓度、Mg2+浓度、dNTP浓度4种因素3个水平,对丹参ISSR-PCR反应体系进行优化分析,并在此基础上对模板DNA浓度、PCR反应过程中的退火温度进行梯度检测。结果表明:20μL ISSR-PCR反应体系中各因素的最佳浓度为1×PCR buffer、200μmol/L dNTP、1.0μmol/L引物、1.5mmol/L Mg2+和1 U Taq DNA聚合酶,最佳模板DNA浓度为20～60ng,引物UBC 835的最佳退火温度为51.7℃。     

浙闽五个红豆树自然保留种群的遗传多样性

红豆树是我国三级保护的珍稀濒危植物,是家具、装饰、雕刻等上等用材。应用ISSR分子标记研究浙闽2省5个红豆树自然保留种群的遗传多样性和种群遗传分化。结果表明,红豆树遗传多样性丰富,物种水平的多态位点百分率高达91．46％,总的种群基因多样性为0．3981,显著地高于其他珍稀濒危树种。研究的5个红豆树自然保留种群虽较小,但皆维持较高水平的遗传多样性,种群多态百分率（PPL）、Nei基因多样性（HE）和Shannon信息多样性指数（I）分别为81．71％～89．02％、0．3498—0．3831和0．5026～0．5506。因现有红豆树种群皆是在过渡采伐后保留下来的,片断化时间较短,种群间遗传分化较小,仅有6．45％的遗传变异存在于自然保留种群间,而种群内的变异占总变异的93．55％。较大的红豆树种群遗传多样性相对较高,应优先加强遗传保育。