表达流行性感冒病毒HA基因非复制型重组腺病毒的构建及免疫效果的研究

通过RT-PCR扩增流行性感冒(流感)病毒HA基因,克隆至腺病毒穿梭载体pAd Track-MV,该重组质粒与腺病毒DNA共转化E．coli BJ5183,通过细菌内同源重组获得重组腺病毒DNA,将其转染293细胞获得重组腺病毒。PCR证实HA基因已整合至腺病毒基因组中,Western blot结果检测到重组病毒感染293细胞中HA的表达。重组病毒经滴鼻和灌胃两种途径免疫小鼠,结果2次免疫后滴鼻组和灌胃组均产生明显的免疫应答,血清IgG抗体滴度分别为1：10000和1：1000。除血清IgG外,还在肺灌洗液中检测到分泌型IgA。滴鼻组的免疫效果强于灌胃组。经小剂量攻毒实验显示,重组腺病毒保护率为100％。该文成功构建了表达流感病毒HA基因的非复制型重组腺病毒,重组病毒免疫小鼠可产生较好的免疫效果。     

拟康氏木霉（Trichoderma pseudokoningii）UV Ⅲ产纤维素酶液体发酵研究

以拟康氏木霉（Trichoderma pseudokoningii)TH为出发菌株,经紫外诱变获得一抗高浓度葡萄糖阻遏突变株UV Ⅲ,其液体发酵最适产酶培养基为（W／V）：豆皮粉3％,硝酸铵0．6％,磷酸二氢钠0．65％,硫酸镁0．25％,氯化钙0．15％,pH5.0;最佳发酵条件为：30℃,125r/min。发酵7d CMCase活力可达103．55IU／mL,滤纸酶活可达5．51IU／mL,β-葡萄糖苷酶活可达0．96IU／mL,分别比出发菌株TH提高了1．40、2．34、0．60倍。     

海洋细菌Cellulophaga sp.QY201产内切纤维素酶发酵条件的研究

本文对海洋细菌Cellulophaga sp.QY201产内切纤维素酶的发酵条件进行了研究.研究结果表明,该菌株最佳产酶的液体培养基组成为(w/v):CMCNa 0.5%,CaSein 0.3%,NaCl 3%,MgSO4·7H2O 0.3%,Na2HPO4 0.15%,NaH2PO4 0.1%,pH=7.0;最佳培养条件为:500mL三角瓶装液150mL,温度为28℃,转速为100 r/min,发酵时间为36h.优化后发酵上清液的内切纤维素酶活力可达到7.85 U/mL,比优化前提高了2.5倍.该菌株产酶发酵条件的研究,为内切纤维素酶的大规模制备及应用奠定了基础.     

在大肠杆菌中提高人α1b型基因工程干扰素的表达

将人α１ｂ型干扰素（ＩＦＮ-α１ｂ）基因插入带有原核增强子样序列的新型载体Ｐｂｖ３２２,使干扰素在大肠杆菌中的表达水平明显高于原表达载体,达到１.６×１０^８ｕ／Ｌ培养液。重组质粒的特点是：含增强子序列Ｘ,ｔｒｐ启动子控制。利用ＤＥＡＥ-Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＣＭ-Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ离子交换层析及单克隆抗体亲和层析纯化ＩＦＮ-α１ｂ,获得了电泳纯产品,其比活性为２×１０^７ｕ／ｍｇ,分子量为１９ｋＤａ。此外,用Ｐａｔ１５３代替Ｐｂｖ３２２,构建了带有和不带有Ｘ序列的两种表达载体,平行对比表明增强子Ｘ序列可以将ＩＦＮ-α１ｂ表达提高４倍     

海洋Cellulophaga sp.QY201产生L-卡拉胶酶的发酵条件优化

目的:通过发酵条件优化,提高海洋Cellulophaga sp.QY201的L-卡拉胶酶产量.方法:采用正交试验分别时发酵条件、培养基配方进行优化.结果:该茵株最适培养基配方为(w/v):3%NaCl、0.5%MgSO4·7H2O、0.02%CaCl2、0.01%KCl、0.002%FeSO4、0.25%CaSein、0.15%Na2HPO4,0.2%NaNO3、0.25%L-卡拉胶.最佳培养条件为:培养基体积为70ml/250ml三角瓶,接种量为1%,25℃,90 r/min培养36 h.优化后酶活最高可迭2.64 U/ml,较优化前提高了22倍.结论:QY201最佳发酵条件的建立,为L-卡拉胶酶的大规模生产创造了条件.     

k-卡拉胶酶CgkX催化区的重组表达菌株筛选和发酵优化

目的：CgkX 是来自QY203 的一种高活性、高稳定性的k-卡拉胶酶，本文旨在构建CgkX 催化结构域 （CgkX-CM）重组表达菌株，并对发酵条件进行优化，提高CgkX-CM 的产量。方法：在分析k- 卡拉胶酶CgkX-CM基因序列的基 础上，构建多种CgkX-CM 表达载体，在大肠杆菌BL21（DE3）中进行重组表达，通过酶活测定筛选其中产量最高的表达菌株，并 优化发酵起始pH、诱导温度、IPTG浓度、装液量以及甘氨酸浓度等因素。结果：构建了5 种重组表达菌株，其中BL21 (DE3)/pET22b-CgkX-CM 酶产量是其他重组菌株的7.4-11.6 倍。确定了该菌株最佳发酵条件为：培养基含1 g·L-1甘氨酸（起始 pH 7.5），装液量为75 mL，0.1 mmol·L-1 IPTG 20 ℃诱导28 h，酶产量是优化前的7.3 倍。结论：经过重组表达载体筛选和发酵优 化，CgkX-CM产量大幅度提高，为今后比较CgkX 全长及其催化区域的酶学性质，确定C 端Big_2 结构域对CgkX的作用奠定了 基础。