单纯疱疹病毒1型引起的发热出疹性疾病需要与手足口病进行鉴别

对2008年在甘肃省发生的一起疑似手足口病(HFMD)的发热出疹性疾病的流行进行病原体的实验室检测,明确引起这起传染病流行的病原体。从4名发热出疹患者采集的8份临床标本中(每个患者采集咽拭子和疱疹液标本),首先将临床标本接种到RD和HEp-2细胞上进行病毒分离,对病毒分离阳性的标本提取病毒核酸,然后使用荧光定量-逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)进行人肠道病毒(HEV)核酸的检测。对HEV检测结果阴性的标本采用序列非依赖的单引物扩增技术(SISPA)进行"未知病原体"的鉴定。分离到的6株病毒均鉴定为单纯疱疹病毒I型(HSV-1),结合分析这起流行中患者的临床表现、流行病学调查结果以及实验室检测结果,表明HSV-1是引起这起发热出疹性疾病流行的病原体。6株HSV-1的gG区核苷酸和氨基酸水平上差异都较小,同源性分别高达98.8%和97.9%,说明这起疫情是由同一个病毒传播链引起的。HSV-1等病毒引起的发热出疹性疾病需要与HFMD进行鉴别诊断,由于仅从临床症状和流行病学资料上判断引起发热出疹性疾病的病原体是非常困难的,因此,必须依赖于实验室的诊断。     

RAPD技术在志贺菌及沙门菌鉴别中的应用

河南农业大学牧医工程学院杨霞、陈陆、许兰菊等五位科学工作者以鸡鲍氏志贺菌,鸡白痢沙门菌和痢疾志贺菌为对象,分别提取基因组DNA,利用6条随机引物以随机扩增多态性DNA（RAPD）技术对其基因组DNA进行了分析,其结果：4条随机引物能较好地在这3种菌中检测到多态性分子标记,共扩增出了59个DNA片段,其中3个菌株共有的谱带7条,而显示多态性的片段有52条,占88．1％。     

杜氏盐藻psaB基因cDNA克隆及系统进化分析

根据真核生物莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、Chlamydomonas moewusii及Chlorella vulgaris等光系统Ⅰ反应中心蛋白psaB基因的氨基酸高度保守序列,设计一对简并引物,利用TRIzol试剂提取杜氏盐藻(Dunaliella salina)细胞的总RNA,通过RT-PCR,得到的一段长为1.8kb左右的cDNA片段。PCR产物经T-A克隆并测序以及测序结果推导成氨基酸序列进行同源性比较,表明所克隆的1815bp序列为杜氏盐藻光系统Ⅰ反应中心psaB基因的cDNA片段,GenBank收录号为AY820754。根据已经得到的psaB的核苷酸序列推导成氨基酸序列与一些已知物种的psaB氨基酸序列相比较,同源性分别为Chlamydomonas reinhardtii 92%,Chlamydomonas moewusii 91%,Chlorella vulgaris 86%,Mesostigma viride 85%,Phy -scomitrella patenssubsp.Patens 85%,Nephroselmis olivacea 84%。此外,psaB密码子偏爱性分析表明:杜氏盐藻psaB基因第三位密码子A和T的组成分别为35.7%和39.17%,而G和C分别为7.27%和17.85%,即杜氏盐藻psaB基因密码子的组成大多为NNA和NNT。根据psaB基因的特征,作者对绿藻门的50个物种的psaB基因作了进化分析,结果表明:杜氏盐藻与Haematococcaceae中的大多数种类进化地位最为接近,这为更进一步弄清杜氏盐藻的遗传背景提供了理论依据。     

大鼠尿激酶SYBR Green I real time RT-PCR引物的设计

设计用于SYBR Green I法实时定量逆转录多聚酶链反应(QRT-PCR)检测大鼠尿激酶型纤溶酶原激活因子(uPA)mRNA的引物。从基因库获取靶基因及相关序列,充分收集争分析相关生物信息学数据,应用Oligo 6.22设计出一对长度为21bp的引物,其GG含量为52.4%;上下游引物3’最稳定二聚体和及发夹结构的能量分别为-1.5、-0.40 kcal/mol和-3.5、-O.90 kcal/mol,引物间最稳定二聚体为-3.1 kcal/mol。5’端和中间△G值较高,高于3’端△G;引发效率分别455和403。实验证明,该引物能够高效、特异地实现对靶序列的检测,适用于SYBR Green I法实时定量检测(uPA)mRNA。     

Changes of 5＇ Terminal Nucleotides of PCR Primers Causing Variable T-A Cloning Efficiency

T-A cloning takes advantage of the unpaired adenosyl residue added to the 3＇ terminus of amplified DNAs by Taq and other thermostable DNA polymerase and uses a Ilnearlzed plasmld vector with a protruding 3＇ thymldylate residue at each of Its 3＇ termini to clone polymerase chain reaction （PCR）-derived DNA fragments. It Is a simple, reliable, and efficient Ilgatlon-dependent cloning method for PCR products, but the drawback of variable cloning efficiency occurs during application. In the present work, the relationship between variable T-A cloning efficiency and the different 5＇ end nucleotlde base of primers used In PCR amplification was studied. The results showed that different cloning efficiency was obtained with different primer pairs containing A, T, C and G at the 5＇ terminus respectively. The data shows that when the 5＇ end base of primer pair was adenosyl, more white colonies could be obtained In cloning the corresponding PCR product In comparison with other bases. And the least white colonies were formed when using the primer pair with 5＇ cytldylate end. The gluanylate end primers resulted In almost the same cloning efficiency In the white colonies amount as the thymldylate end primer did, and this efficiency was much lower than that of adenosyl end primers. This presumably is a consequence of variability In 3＇dA addition to PCR products mediated by Taq polymerase. Our results offer instructions for primer design for researchers who choose T-A cloning to clone PCR products.     

基于种特异性SS-COⅠ技术快速鉴定瘤胫实蝇

[目的]瘤胫实蝇为我国进境植物检疫性有害生物。寄主范围广、危害大,形态与其同属近缘种相似,传统鉴定方法是将果蔬上的各虫态饲养至成虫后进行分类鉴定,鉴定周期较长,影响口岸进境果蔬快速通关,而采用分子鉴定不仅快速且不受虫态影响。[方法]选用瘤胫实蝇为鉴定靶标,番石榴实蝇、锈红果实蝇等19种实蝇作阴性对照,应用种特异性技术,基于mtDNA COⅠ线粒体基因序列,研究筛选并设计一对种特异性引物(SS-COⅠ) LJF400和LJR564,进行PCR扩增并将PCR产物进行电泳检测。[结果]种特异性引物仅对靶标种瘤胫实蝇的COⅠ基因有扩增能力,能扩增出一条单一的长度约165 bp清晰的条带,而对其余阴性对照种均不具有扩增效果,未出现任何条带。[结论]设计的种特异性引物具高特异性,能够快速准确鉴定瘤胫实蝇,适用于各种虫态,对瘤胫实蝇的检疫鉴定和进境果蔬的快速通关具有重要意义。     

青鱼微卫星标记的开发与特性分析

青鱼(Mylopharyngodon piceus)是中国最为重要的淡水养殖鱼类。开发青鱼的微卫星标记能为青鱼的遗传多样性分析提供更多工具。本研究使用磁珠富集法,利用生物素探针(CA)10和(GACA)6,富集得到青鱼基因组微卫星片段,进一步通过设计微卫星引物检验其在青鱼原种群体中的有效性和多态性水平。结果显示,所构建文库中849个克隆含有微卫星序列,通过利用PCR技术在吴江原种青鱼36个个体中进行多态性筛选,获得了25个多态性微卫星位点。其平均等位基因数(Na)和有效等位基因数(Ne)分别为7.08和3.526,平均观测杂合度(Ho)和期望杂合度(He)分别为0.602和0.619,平均多态信息含量(PIC)为0.568。其中,Mp23、Mp27和Mp35这3个位点极显著偏离哈迪-温伯格平衡(P 0.01)。本研究开发的微卫星标记能为青鱼种质资源的评价和保护等研究提供工具。     

应用RAPD标记分析黑麦属品种的遗传多样性

四川农业大学小麦研究所侯永翠、郑有良、魏育明等研究人员对黑麦遗传多样性课题作了研究。他们采用随机扩增多态性DNA(RAPD)标记 ,对黑麦属 (SecaleL) 7个品种共 1 2份材料进行了遗传多样性检测 ,发现被检测材料间RAPD标记多态性较高 ,在 4 0个随机引物中 ,有 2 5个引物约占整个的 6 2 .5 %的扩增产物具有多态性。这 2 5个中共扩增出 1 6 7条带 ,其中 89条带约占 5 3.2 %具有多态性 ,每个引物可扩增出 1～ 1 0条多态性带 ,平均为 3～ 6条。RAPD标记遗传距离GD变异范围为 0 .1 382～ 0 .4 5 1 2 ,平均为 0 .2 71 2。通过聚类分析表…     

等位基因特异性引物PCR技术及其应用研究

目的：研究建立等位基因特异性引物PCR技术体系,并将其应用于基因单核苷酸多态性研究工作。方法：通过美国国家生物信息中心(NCBI)的genBank获取基因序列及其相应位点的SNP信息。利用Primer5．0软件设计引物,并经NCBI的Blast2．0软件检验其特异性。结果：建立了单一等位基因特异性引物PCR(SASP—PCR)与嵌套式等位基因特异性引物PCR(NASP-PCR)两种技术,并应用于β2肾上腺素受体及内皮源性一氧化氮合酶基因单核苷酸多态性的研究,证实该技术的稳定性和优越性。结论：等位基因特异性引物PCR技术是一种更为简便、特异性较高、费用少的、便于推广的SNP检测方法,特别是在群体基因单核苷酸多态性研究中更有优势。     

RT-PCR一步法检测甲型肝炎活病毒方法的建立

建立灵敏、特异、快速检测甲型肝炎活病毒(HAV)的方法。提取HAV总RNA,选用HAV高保守区为目标区,设计合成一对引物,通过RT-PCR反应扩增其核酸,用琼脂糖凝胶电泳法检测其扩增产物,紫外灯下观察,约200bp处为目标片段,根据观察结果,计算HAV滴度。RT-PCR一步法快速、灵敏、重复性好、特异性强,可用于甲型肝炎活病毒检测。