野生动物种群DNA甲基化进展分析

DNA甲基化通常是指胞嘧啶第5位碳原子和甲基基团的共价结合,可调节基因表达程度,参与有机体的重要生命过程,是目前研究最为透彻的表观遗传过程之一。环境变化可以诱导DNA甲基化的变异,这可能是有机体适应新环境的有效途径之一。研究表明,在不同环境下生存的野生动物,其种群内和种群间均存在显著的DNA甲基化差异;同时,相对于遗传多态性水平,野生动物具有更高的表观遗传多态性水平,表明至少有一部分的表观遗传变异独立于遗传变异,这是DNA甲基化具备潜在进化作用的一个先决条件。DNA甲基化变异可能促进了野生动物种群表型多样化,且一些变异的DNA甲基化模式和水平可跨代遗传,可使其快速适应新环境,有助于种群的扩散和进化。这些研究有助于深入理解野生动物种群中非遗传分歧诱导的一些可遗传的表型现象,洞察野生动物种群环境适应性的表观遗传机制,以及DNA甲基化在物种进化中具有的潜在作用,同时我们也对野生动物种群DNA甲基化研究工作的不足进行了探讨和展望,为野生动物种群的表观遗传研究提供理论依据。     

邻近标记在蛋白质组学中的发展及应用

人体内各种复杂的生命活动离不开蛋白质之间的相互作用。这种相互作用具有瞬时性和结合力弱等特点,并受到多种动态调节,特别是蛋白质翻译后修饰（post-translation modifications, PTM）。传统的亲和质谱检测方法存在蛋白纯化的局限性,在高效检测到动态变化方面存在不足。邻近标记是一种能够给与靶蛋白质瞬时靠近,或者互作（邻近）的蛋白质加上生物素的技术,它与质谱检测技术的联合使用能检测细胞过程中弱的、瞬时的蛋白质相互作用,有效解决上述问题。本文综述了基于生物素的邻近标记方法的发展现状,从依赖于融合序列的生物素标记开始,依次介绍有关生物素连接酶、过氧化物酶及其进化后的2代标记方法等经典生物素标记的方法和原理,比较各个方法间的差异和优缺点;也列举了一些近年来新出现的标记方法,如将生物素连接酶进行拆分、鉴定蛋白质在不同复合物中功能的方法、抗体靶向的标记方法,以及其他来源的生物素连接酶突变体,例如枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的C端氨基酸突变的生物素连接酶,能够应用在苍蝇和蠕虫中的生物素连接酶突变体。本文对这些方法进行归纳总结,旨在为初步接触该领域的科研工作者提供参考,同时也希望能够提供一些新的思路,推动蛋白质相互作用组学的发展。     

病原菌调节宿主细胞泛素化途径的研究进展

泛素化是真核生物特有的蛋白质翻译后修饰,广泛地参与宿主细胞各种信号通路和生理过程.病原菌常通过分泌毒性效应蛋白,对泛素和泛素结合酶进行独特的共价修饰,或者利用泛素连接酶和去泛素化酶的酶学活性,调节宿主泛素化过程,从而干扰宿主细胞的信号转导,促进细菌的感染和生存.本文概述了病原菌效应蛋白调节宿主泛素化途径的主要研究进展和最新发现.     

天然产物的C-糖基化研究进展

自然界中的天然产物在其结构上存在各种修饰,C-糖基化为其中一种比较稀少的修饰方式.C-C糖苷键的形成由C-糖基转移酶负责催化.含C-糖基的化合物多数来自微生物,但高等植物也会有少量积累.综述了近些年来在天然产物C-糖基化方面的研究工作,并对其在药物开发方面的潜力进行了展望.     

谷氨酰胺转氨酶研究进展

谷氨酰胺转氨酶是一种催化酰基转移反应的转移酶,它可使蛋白分子间和分子内产生共价交联,从而改变蛋白的功能特性,在食品、医药、化妆品、纺织等领域具有重要的潜在应用价值。研究表明,谷氨酰胺转氨酶广泛存在于生物组织中。为了更好的研究开发这一资源,对谷氨酰胺转氨酶的来源、理化特性、作用机制、功能以及工业生产的现状进行了综述,其中重点探讨了不同来源的谷氨酰胺转氨酶在理化特性以及底物特异性方面的差异。     

真核生物细胞质tRNA生物合成研究的进展

tRNA是蛋白质翻译机器中的必需成分,它对细胞的生长和增殖及器官的发育起着决定性作用.tRNA生物合成包括tRNA基因的转录、转录后的加工和修饰.对tRNA生物合成的研究还包括tRNA在细胞中的运输、tRNA生物合成的质量监控及其与其他重要细胞途径（如mRNA生物合成、DNA损伤应答和细胞周期）之间的相互作用,以及tRNA生物合成在生长发育和疾病中的作用.本文主要介绍了近年来真核生物细胞质tRNA生物合成研究的一些重要进展.     

重组人粒细胞集落刺激因子的N端氨基定点PEG化修饰

尽管重组粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)具有重大的治疗价值,然而在实际应用却受到体内半衰期过短因而需要频繁重复注射的限制．为了解决这一问题,我们利用两种不同分子量（5 kD和 20 kD）的单甲氧基聚乙二醇丙醛（mPEG-PAL）对rhG-CSF的N端氨基进行了定点PEG化修饰．通过正交实验的统计学方法得到了最适修饰条件．研究发现,PEG化后的rhG-CSF具有了更高的体外稳定性,其体内活性也得到了很大提高,体内作用时间得到很大延长．因此,对于rhG-CSF的N端氨基定点PEG化修饰,可以显著提高rhG-CSF的临床应用价值．     

重叠延伸PCR法构建小鼠Sumf1基因的定点突变真核表达载体

前期通过染色质免疫沉淀技术（chromatin immunoprecipitation assay,CHIP）筛选出了转录因子activator protein．2 alpha（AP-2α）的靶基因Sumf1．采用重叠延伸PCR定点诱变技术,对AP．2α在Sumf1内含子片段上的两个结合位点的碱基进行定点突变,并构建定点突变表达载体．DNA测序表明,Sumf1内含子片段103—111bp,411～419bp两处的碱基已分别由GCCGTCAGG突变为GAAGTCCTG,由GCCTCTAGG突变为GGATCTCTG,成功实现定点诱变,为进一步研究AP-2α对基因Sumf1的表达调控奠定了基础．     

利用CRISPR/Cas9系统检测果蝇细胞中组蛋白甲基化修饰对20E信号传导的调控

【目的】利用CRISPR/Cas9基因敲除系统在黑腹果蝇Drosophila melanogaster细胞中筛选并检测组蛋白甲基化修饰对蜕皮激素20 羟基蜕皮酮(20-hydroxyecdysone, 20E)信号传导的调控。【方法】通过Flybase网站分析并总结黑腹果蝇组蛋白甲基转移酶及其修饰位点;将5个组蛋白甲基转移酶基因［trr, Mes-4, ash1, Su(var)3-9和egg］的sgRNA插入到敲除载体pAc-sgRNA-Cas9骨架中并转染黑腹果蝇Kc细胞,利用TA克隆和测序鉴定突变位点。以Trr正调控20E初级应答基因Br-C的转录表达为阳性对照,利用qRT-PCR和Western blot检测该系统敲除靶基因的有效性;通过检测20E应答元件(20E response element, EcRE)双荧光素酶活性确定trr, Mes-4, ash1, Su(var)3-9和egg是否参与20E信号传导。【结果】果蝇组蛋白甲基化修饰主要发生在组蛋白H3的赖氨酸残基上,H3的精氨酸残基和组蛋白H4的甲基化修饰较少。trr敲除载体pAc-trr-sgRNA-Cas9转染Kc细胞后成功突变trr,降低H3K4三甲基化水平并阻断20E对其初级应答基因Br-C的转录诱导,证明该敲除系统的有效性。除trr之外,Mes-4和egg的敲除降低EcRE的双荧光素酶活性。【结论】插入靶标基因sgRNA序列的pAc-sgRNA-Cas9敲除载体在果蝇Kc细胞中可以有效快捷地突变靶基因。利用该敲除系统发现,除Trr之外,Mes-4和egg影响EcRE的活性而参与20E信号传导。本研究为昆虫细胞CRISPR/Cas9介导的基因敲除和组蛋白甲基化修饰调控20E信号传导的深入研究提供了理论依据与工作基础。