一种融合抗体ScFv-Fc通用表达载体的构建

为了构建一个可供自由替换的ScFv区,表达人小分子融合抗体ScFv-Fc的通用载体,利用RT-PCR技术扩增人抗体IgG1的Fc片段克隆至毕赤酵母表达载体pPICZα,将一段人工合成的互补寡核苷酸链插入重组载体pPICZα/Fc中Fc区的上游,引入2个可供小分子抗体ScFv-Fc的ScFv区自由替换的限制性酶切位点。分别扩增人抗狂犬病毒以及抗乙型肝炎表面抗原的ScFv片段,克隆至已构建的通用载体pPICZα/Fc,在毕赤酵母中诱导表达。进一步在1L条件下对活性抗体进行发酵,并利用protein A亲和层析柱进行纯化。应用酵母基因组PCR、ELISA、Western blotting、活性检测等试验对此小分子抗体的表达进行生物学及免疫学分析。结果表明具有狂犬病毒抗原结合活性以及乙肝表面抗原结合活性的人源抗体分子均获得成功表达,1L发酵条件下表达量达到20~30mg/L, protein A亲和层析纯化后纯度＞95%。研究构建了可用于功能性抗体分子ScFv-Fc筛选和表达的通用载体并对其发酵、纯化条件进行了摸索,为重组抗体分子诊断、治疗试剂的开发以及抗体的人源化奠定了物质基础。     

AFM对小鼠胚胎干细胞的形态学研究

目的：对已建系BALB/c小鼠胚胎干细胞膜表面进行纳米级超微结构的初步形态学研究,从而为从分子水平研究胚胎干细胞的增殖与分化调控机理奠定基础。方法：利用原子力显微镜（AFM）,在空气中对小鼠胚胎干细胞膜表面扫描成像。结果：AFM图像表现BALB/c小鼠胚胎干细胞呈圆盘状,直径约10-15μm,高约2-4μm,胚胎干细胞膜表面比较复杂,随着扫描范围的减小,切向分辨率逐渐增大,可达到纳米分辨,细胞表面有许多紧密堆积的椭球状颗粒。颗粒尺寸（x-y方向）为40-80nm。结果：利用AFM可以得到胚胎干细胞表面高分辨的,可重复的图像。     

硫酸软骨素自组装膜上草酸钙Liesegang环的AFM研究

运用原子力显微镜（Atomic Force Microscope,AFM）研究了草酸钙在硫酸软骨素自组装膜上受控凝集结晶的现象,发现当硫酸软骨素的浓度为1.0g/L时,在云母表面形成的网状基底可以诱导过饱和的草酸钙溶液凝集结晶形成Liesegang环,这是草酸钙晶粒在膜表面扩散凝聚的结果,该环的形成和基底物的浓度以及草酸钙本身的过饱和度密切相关。表明了金属离子和硫酸软骨素分子之间复杂的相互作用与尿结石中的环状结构存在着一定的关系。从电荷聚集与晶格匹配等方面对Liesegang环的形成机理作了初步的探讨,为深入研究尿结石中环结构的形成提供了一定的实验依据。     

大鼠部分肝切除前后热激处理对过氧化物酶基因表达的影响

用过氧化物酶原位复性电泳(SDS-POD-PAGE)技术分析了部分肝切除(partial hepatectomy,PH)、部分肝切除后再热激(partial hepatectomyfollowing heat shock,PH-HS)和先热激再部分肝切除(heat shock follow ing partial hepatectomy,HS-PH)后肝再生期间过氧化物酶(POD)基因表达差异,结果表明,PH中表达的POD基因种类(7个)>PH-HS(5个)>HS-PH(3个);三个模型的POD总活性为:HS-PH>PH>PH-HS.根据实验结果推测,POD在肝再生和肝损伤恢复中起一定作用。 Abstract:Expression difference of the peroxidase(POD)genes during liver regeneration after partial hepatectomy(PH),partial hepatectomy following heat shock(PH-HS)and heat shock following partial hepatectomy(HS-PH)was analyzed by POD renatured electrophoresis(SDS-POD-PAGE).The results showed that the expressed POD gene kinds in PH,PH-HS and HS-PH were 7,5 and 3 respectively,and that the total activities of POD in the three models were HS-PH>PH>PH-HS.The results suggested that POD play some roles during liver regeneration and in recovery after liver damage.     

人金属硫蛋白在乳酸菌中的融合表达及其预防食源性镉污染的应用

目的:镉(Cd)是一种重要的环境污染物,其具有半衰期长、不能生物降解等特性使之易于在人体重要脏器中蓄积并对人身体健康造成不可逆的损伤。为此,减少镉的摄入,尤其是经胃肠道,是预防人体慢性镉中毒的有效方法。方法:构建以α-半乳糖苷酶作为筛选标记、表达金属硫蛋白融合蛋白(GST-SUMO-MT)的重组乳酸乳球菌MG1363/p M-GSMT。原子吸收光谱法分析重组乳酸菌对Cd~(2+)和Zn~+的结合能力。以灌胃方式,对雄性Sprague-Dawley大鼠每天口服不同剂量的重组乳酸菌(2×10~9~2×10~(11)CFU/d)及CdCl_2溶液[5mg/(kg·d)],连续处理56天。收集实验动物肝、肾、脑及睾丸,利用原子吸收光谱法检测这些脏器中镉离子的含量。生化分析检测血清中尿素及丙氨酸转氨酶的含量。石蜡切片及苏木精-伊红染色分析各组织的病理变化。结果:获得不含抗生素抗性的重组乳酸菌MG1363/p M-GSMT,其吸附Cd~(2+)、Zn~(2+)能力比对照组分别提高3.52倍和1.60倍。动物实验结果显示,镉能在肝、肾、脑及睾丸中蓄积,并对这些器官造成明显的病理损伤。原子吸收光谱分析、血清生化指标及病理切片结果都显示,重组乳酸菌能有效降低胃肠道中镉的摄入,进而减少Cd~(2+)在各脏器中的蓄积及对器官功能的损伤。结论:为预防人体食源性慢性镉中毒提供了一种有效的生物材料和使用方法。     

我国部分地区即食食品和蔬菜中金黄色葡萄球菌污染分布及耐药和基因分型情况

【目的】系统调查了我国15个代表性城市在即食食品(卤肉、烤肉、凉拌菜和巴氏奶)和蔬菜样品中金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的污染分布情况,并对分离株进行耐药性分析及多位点序列分型(Multilocus sequence typing,MLST)研究,为食源性金黄色葡萄球菌的风险识别和分子溯源提供基础数据。【方法】依据GB 4789.10-2010对540份即食食品和蔬菜样品进行定性和最大可能数(Most probable number,MPN)分析;采用K-B纸片扩散法检测金黄色葡萄球菌分离株的耐药特征并通过PCR检测mecA基因;应用MLST方法确证金黄色葡萄球菌的主要ST型。【结果】结果发现9.3%(50/540)的样品中检出金黄色葡萄球菌,其中卤肉污染率最高,为16.3%(30/184),其次为烤肉(9.2%,6/65),蔬菜(6/150,4.0%)污染率最低。定量分析发现62.0%的阳性样品污染水平处于0.3–1.0 MPN/g,其中3份阳性样品污染水平≥110 MPN/g。对50株分离株进行24种抗生素耐药性检测,发现82.0%的分离株对氨苄西林和青霉素耐药,64.0%的分离株为多重耐药株。对mecA阳性分离株进行SCCmec分型,发现均为SCCmecⅣa。所有分离株进行MLST分型,共检出14种型别,其中ST3595和ST3847为新ST型。【结论】普遍的多重耐药性表明我国食源性金黄色葡萄球菌的耐药状况已较为严重,对消费者的安全健康存在潜在威胁。ST型与耐药存在一定的关联性,这为进一步了解该菌在我国食品中的流行趋势和风险评估提供了科学的数据支撑。     

亚热带城市河流底栖动物完整性评价——以流溪河为例

根据2016年前、后汛期及枯水期流溪河14个断面底栖动物群落组成数据(4门8纲22目52科94属103种),采用底栖动物完整性指数(B-IBI),首次对亚热带地区河流进行健康评价。经筛选(32个候选指标),流溪河B-IBI体系由5个核心指标(总生物量,敏感类群个体%,EPT、摇蚊和耐污类群单元数)组成,评价标准为:健康3.24,亚健康3.24—2.43,一般2.43—1.62,差1.62—0.81,极差0.81,评价结果为:健康位点数占14.3%、亚健康50.0%、一般21.4%、差14.3%、无极差。总体上,B-IBI值反映流溪河上游健康状况较好,以EPT分类单元数和敏感类群个体%贡献最高,下游健康状况恶化,以耐污类群单元数贡献最高。此外,上游支流健康状况要优于上游干流,而下游则情况相反。相关性分析显示,B-IBI值与溶解氧呈极显著正相关(P0.01),与电导率、氨氮、总氮和总磷呈显著负相关(P0.05),反映流溪河当前健康水平受水体污染影响严重。核心指标与环境因子间CCA分析显示,前2主轴对环境因子解释度达68.1%,且对上、下游及干、支流有明显的梯度划分,说明所建B-IBI在流溪河有较高适用性。对比不同温度带研究结果发现,B-IBI体系受人为干扰和水体污染影响更加明显,体现其评价功能不受地理区域影响。     

基于单波长激发的定量FRET成像

本文发展了一种针对于固定FRET质粒的单波长激发的E-FRET方法(SDW-E-FRET)。相比于EFRET方法,SDW-E-FRET只需要测量供体激发时供体通道的荧光强度(IDD)和FRET通道的荧光强度(IDA),因此该方法可以实现活细胞的快速定量FRET成像。结合双通道荧光显微成像系统,该方法无需任何机械切换,定量FRET成像的速度只取决于CCD相机的成像速度,因而特别适合活细胞实时动态定量FRET成像。在本研究小组发展的双通道荧光显微镜平台上,应用SDW-E-FRET方法测量了C5V和C17V的FRET效率,得到了与其它方法测量的一致的结果。     

SAHA抑制间充质干细胞C3H10T1/2的增殖与成脂分化

本文研究组蛋白去乙酰化酶抑制剂辛二酰苯胺异羟肟酸（suberoylanilide hydroxamic acid,SAHA）对间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs) C3H10T1/2增殖和成脂分化的影响及其可能的作用机制.用Western印迹验证SAHA对细胞内蛋白乙酰化的影响;用MTT和流式细胞术检测细胞活性和细胞周期;利用油红O染色检测细胞成脂分化,实时定量PCR检测PPARγ2和成脂分化标志物Fabp4、perilipin以及adipoq mRNA的转录.Western印迹结果显示,SAHA可促进细胞内蛋白的乙酰化.MTT和流式细胞术结果显示,SAHA对C3H10T1/2细胞活性的抑制呈浓度依赖性,随着SAHA浓度增加,细胞形态趋向于展平,并将细胞周期抑制在G0/G1期;SAHA可呈浓度依赖性抑制C3H10T1/2 细胞的成脂分化作用.同时实时定量PCR结果显示,SAHA抑制成脂关键转录因子PPARγ2,脂肪因子Fabp4、perilipin和adipoq mRNA的转录.综上所述,SAHA可影响间充质干细胞C3H10T1/2细胞形态,并呈剂量依赖性地抑制其增殖和成脂分化.     

MicroRNAs研究方法与技术

MicroRNAs简称miRNAs(微小RNAs),是真核生物、原核生物以及病毒中由非编码蛋白基因转录的初级microRNAs加工成的调控因子.在转录后水平和蛋白质翻译水平,microRNAs通过降解或翻译抑制甚至激活来调控靶mRNA.实验和计算机方法已应用于microRNAs和靶基因的鉴定.大规模测序技术使得microRNAs在不同物种的多样性分析得以实现.着重介绍microRNAs、靶基因及其功能研究的实验技术和计算机方法,以及基于microRNAs的保守性,借助模式生物中已知的microRNAs,研究其在其他生物中的功能和作用.