家蚕羧酸酯酶基因克隆及差异表达

家蚕浓核病毒 (Bombyx mori densonucleosis virus,BmDNV)是蚕业生产上危害比较严重的一类病毒。用完全抗浓核病中国镇江株(BmDNV-Z)的家蚕品系秋丰、感性品系华八及以华八为轮回亲本回交8代和自交8代构建的近等基因系BC₈为材料,采用mRNA荧光差显技术首次分离克隆了家蚕羧酸酯酶（B. mori carboxylesterase,BmCarE）基因全长cDNA,并用实时荧光定量PCR检测了添毒后12 h、36 h、72 h BmCarE在感、抗BmDNV-Z家蚕品系中肠内的表达差异。结果表明： （1）添毒后12 h不同品系家蚕中肠BmCarE表达差异最大,抗性品系BC₈和秋丰分别是感性品系华八的17.714倍和3.602倍,三者彼此间的差异达到极显著水平;（2）同一品系添毒后12 h与添清水后12 h BmCarE表达也有较大差异, BC₈添毒是BC₈添清水的15.08倍, 秋丰添毒是秋丰添清水的3.39倍, 差异达到极显著水平,而华八添毒和添清水的BmCarE表达量均低,二者差异不显著;（3）同一品系添毒后不同时间BmCarE表达也有较大差异, BC₈和秋丰添毒后12 h BmCarE表达量最高,显著高于各自添毒后36 h和72 h表达水平,而添毒后36 h与72 h表达无显著差异;华八添毒后12 h、36 h和72 h,BmCarE表达无显著差异。上述结果提示羧酸酯酶基因可能与家蚕抗浓核病毒有一定关系。     

家蚕中肠组织抗核型多角体病毒病的相关蛋白分析

家蚕中肠上皮是病毒经口侵入遇到的第一个组织。昆虫幼虫抵御杆状病毒的感染,可通过选择性的使感染的中肠上皮细胞发生调亡并在释放病毒粒子进入血淋巴之前使感染的细胞从中肠脱落。为研究家蚕抗核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus, BmNPV)病的机制,通过对BmNPV高度抗性和高度敏感性的家蚕品系杂交和回交构建了近等基因系。本文对家蚕高抗,敏感及近等基因系5龄起蚕中肠组织的蛋白质表达谱进行了二维电泳 (two-dimensional gel electrophoresis,2-DE) 分析,并利用基质辅助激光解吸电离飞行时间 (matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight, MALDI-TOF) 质谱对差异蛋白进行鉴定。结果发现了5个差异表达的蛋白。推测这些蛋白可能与家蚕中肠对BmNPV的抗性或感性有关。     

家蚕浓核病毒中国株非结构蛋白1(NS1)的表达

利用PCR技术扩增出BmDNV-3 NS1基因,将目的基因与原核表达载体pET-30a进行连接,转化BL21 star菌并在该菌中表达,经Western blot鉴定表达的产物为BmDNV-3 NS1蛋白,纯化NS1蛋白并制备兔多克隆抗体.同时BmDNV-3 NS1基因亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBae-HTb-eGFP中,转化BmDH10BAC感受态细胞,提取的重组Bacmid通过脂质体包埋转染家蚕BmN细胞,再以收获的重组病毒感染家蚕幼虫.家蚕BmN细胞和幼虫感染重组病毒2d后均观察到绿色荧光,经SDS-PAGE分析真核表达的产物与预测的NS1-eGFP融合蛋白大小不一致,说明NS1-eGFP融合蛋白被昆虫内源性的蛋白酶降解.降解的产物用NS1蛋白抗体进行Western blot鉴定为BmDNV-3 NS1蛋白.     

家蚕抗BmNPV品系与感性品系血淋巴液蛋白质组的差异分析

利用遗传学的原理, 通过杂交和回交的方法, 建立家蚕抗BmNPV、感BmNPV以及近等基因系模型, 利用2-D电泳和MALDI TOF/TOF MS质谱技术, 从蛋白质组水平上研究家蚕对BmNPV抵抗性。其结果是获得家蚕高抗NB, 高感306, 近等基因系BC8五龄起蚕血淋巴液蛋白质差异表达谱, 分别获得180、190、187个蛋白点, 其中80%的蛋白点集中在等电点5~9范围之内。从三块凝胶上共获得明显差异蛋白点12个, 由质谱鉴定出5种蛋白, 其中氨基酰化酶(Aminoacylase)仅出现在抗性品系NB、近等基因系图谱中, 感性品系没有出现, 初步推测是家蚕抗BmNPV特有蛋白, 这是首次报道结果。     

TGF-β1对卵巢癌细胞A2780增殖及迁移侵袭的影响

目的:探讨TGF-β1对卵巢癌细胞A2780增殖、迁移及侵袭能力的影响。方法:以体外培养的卵巢癌细胞A2780为研究对象,给予不同浓度(0、2、4…20 ng/m L)TGF-β1处理不同时间(12、24…72 h)。采用CCK-8法检测不同的浓度TGF-β1处理不同时间对卵巢癌细胞A2780增殖的影响。根据增殖实验结果选择合适的TGF-β1作用浓度及处理时间,采用细胞划痕实验测定细胞的迁移能力,Transwell实验检测细胞的侵袭及迁移能力。结果:相较于空白对照组,TGF-β1可以剂量和时间依赖性显著促进卵巢癌细胞A2780的增殖(P0.05)。细胞划痕实验结果显示TGF-β1处理组ΔS%/h明显高于空白对照组(P0.05);Transwell迁移实验结果显示:TGF-β1处理组OD570明显高于空白对照组,差异具有统计学意义(P0.05)。Transwell细胞侵袭实验结果显示:与空白对照组相比,TGF-β1处理组OD570明显升高(P0.05)。结论:TGF-β1可以明显促进卵巢癌细胞系A2780的增殖、迁移及侵袭能力,其促增殖效应呈剂量/时间依赖效应。     

家蚕耐氟基因RAPD分子标记的筛选及其克隆

为获得家蚕耐氟基因的分子标记,以家蚕耐氟品种T6和高敏感品种733新为材料,并构建了其近等基因,采用300个随机引物进行RAPD扩增,获得了与家蚕耐氟性有关的一个分子标记,此标记由引物S250扩增得到,并在F2代分离个体中得到验证,证明了此分子标记的可靠性,进而将此标记克隆进T载体pmd-18中,完成测序,分析发现此序列是未有报道的新序列。     

家蚕性别决定研究进展

作为模式生物和经济昆虫,家蚕的性别决定向来受到广泛的关注,近年来更得到深入的研究.主要在分子水平上概述了国内外有关家蚕性染色体方面最新的研究状况,通过对比,探讨了家蚕的几个可能决定性别的基因及其作用过程,以及可能的性别决定靶基因,并就目前性别决定研究现状中的几个突出的问题进行了探讨.     

蛋白质起始的DNA病毒复制机制

DNA聚合酶在DNA合成过程中需要的引物包括RNA引物、DNA自我引物和蛋白质引物3种类型。新DNA链(如冈崎片段)的复制多是在DNA模板上合成一段RNA引物,细小病毒利用其基因组末端的反向末端重复序列(ITRs)自我折叠成DNA引物,而一些DNA、RNA病毒及真菌质粒起始复制反应的引物则是蛋白质。以感染原核生物的噬菌体Phi29和真核DNA病毒腺病毒为例,从复制过程所涉及的蛋白质、对复制原点的识别、复制起始反应、新链的延伸、复制终止过程等方面详细阐述DNA病毒由蛋白质引发的复制机制,并对已商品化的Phi29 DNA聚合酶产品多重置换扩增及单细胞测序等的应用以及基于噬菌体Phi29蛋白质起始的最小复制系统体外扩增异源DNA等最新的应用研究作相关总结介绍。     

昆虫线性单链DNA病毒表达策略研究进展

昆虫线性单链DNA (linear single-stranded DNA, linear-ssDNA)病毒感染的昆虫种类很广泛。它们主要归属于细小病毒科(Parvoviridae)的浓核病毒亚科(Densovirinae)和二分DNA病毒科(Bidnaviridae)。近年来,随着宏基因组学方法的发展,越来越多的昆虫linear-ssDNA病毒被发现,其基因组转录模式也逐渐被解析。昆虫linear-ssDNA病毒的基因组具有双义和单义两种类型,因此,该文将阐述双义和单义两种类型基因组的表达策略特征。总结来讲,其主要是通过未剪接(unsplicing)、选择性剪接(alternative splicing)、选择性多聚腺苷酸化(alternative polyadenylation)等转录方式产生多种转录本,采用选择性起始(alternative initiation)、漏扫描(leaky scanning)或移框(frameshifing)等方式表达蛋白质。现综述昆虫linearssDNA病毒的表达模式类型和研究进展,为研究其他的linear-ssDNA病毒的表达策略提供理论参考。     

MicroRNA-141在上皮性卵巢癌患者组织和血清中的表达及临床意义的探讨

目的：探讨微小RNA-141（miR-141）在卵巢癌患者组织和血清中的表达情况并初步探讨其作为肿瘤标记物早期诊断上皮性卵巢癌的可行性。方法：采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（real-timeRT—PCR）检测16例上皮性卵巢癌患者和4例正常人卵巢组织及血清标本中miR-141的表达;检测4例良性卵巢肿瘤血清中miR-141的表达。结果：miR-141在卵巢癌患者组织中相对表达量分别为（72．846±76．671）显著高于正常人（2．869±3．201）（P〈0．05）;miR-141在卵巢癌患者血清中相对表达量（31．581±52．885）显著高于良性卵巢肿瘤患者（0．668±1．196）和正常人（1．690±1．697）（P〈0．05）,后两组间表达无差异（P〉0．05）;miR-141表达随卵巢癌临床分期的进展呈上升趋势（P〈0．01）,在无淋巴结转移组明显高于有淋巴结转移组（P〈0．05）,与组织分级和CA125的升高无关（P〉0．05）。在组织中miR-141表达水平与上皮性卵巢癌临床病理特征均未见明显差异（P〉0．05）。结论：miR-141可能在上皮性卵巢癌的发生发展中发挥癌基因的作用;miR-141用于检测上皮性卵巢癌敏感性和特异度较高,有望成为上皮性卵巢癌早期诊断的新指标。