家蚕浓核病毒中国株基因组DNA的分离纯化与鉴定

家蚕浓核病毒中国株的正链DNA和负链DNA分别包裹在不同的病毒粒子中,而且两条链的大小不同,经高盐浓度的DNA抽提缓冲液提取后,在琼脂糖凝胶电泳谱中呈现出大小不同的两条带,一条6．4kb,另一条5．8kb。作者分别用高盐和低盐抽提缓冲液提取了家蚕浓核病毒中国株的基因组DNA,意外发现用低盐抽提缓冲液抽提出来的基因组DNA在琼脂糖凝胶电泳谱中仅呈现一条带。推测可能是由于大小不同且不完全互补的正负链,在低盐缓冲液中形成有效的互补,因而呈现一条6．2kb的条带。     

家蚕浓核病毒DNV-3（中国株）的VD2基因组序列分析

浓核病毒BmDNV-3(中国株)基因组中含有两种不同的单链线形DNA分子(VD1,VD2)。该病毒的VD2被分离、纯化、克隆到pUC119载体上,并完成了VD2全基因组序列的测定。序列分析显示:VD2全基因组长为6022个核苷酸,末端拥有524个核苷酸反向重复序列(ITRs)。VD2基因组正链含有2个大的开放阅读框,负链含有1个小的开放阅读框。计算机分析推测该基因组正链上开放阅读框(ORF1)及负链上开放阅读框(ORF3)主要编码病毒的非结构蛋白,而正链上开放阅读框(ORF2)主要编码病毒的结构蛋白。比较BmDNV-3 VD2和BmDNV-2(Yamanashiisolate)VD2基因组全序列,两者同源性达97.7%,并且有132个碱基的替代1、1个碱基的删除和2个碱基插入。研究结果显示BmDNV-3 VD2和BmDNV-2 VD2有很近的亲缘关系,但也发生一定的变异,这为更好地理解浓核病毒种类的多样性,也为研究家蚕浓核病毒进化提供了有益的线索。     

昆虫及其病毒基因启动子的研究及应用

分子生物学研究领域中,基因结构、功能和表达调控的研究逐渐成为热点.启动子作为基因表达调控的重要元件,深入研究其结构和功能,对于阐明真核细胞基因表达调控和基因调节机制意义重大,同时也为揭示病毒的致病机理从而防治相关疾病提供依据,另外,也为病毒新型表达载体鉴定和构建奠定基础.综述了启动子克隆方法及应用,阐述了启动子的一般特点,介绍了研究启动子功能的常用方法及在科研中的应用前景,着重介绍了该领域的最新进展.     

利用Red系统快速敲除家蚕核型多角体病毒orf60基因

用Red重组系统和最近构建的家蚕核型多角体病毒(BmNPV)bacmid在大肠杆菌BW25113中快速地敲除BmNPVorf60基因。从大肠杆菌BmDH10Bac中提取BmNPVbacmid,将其电转化到含有质粒pKD46(能表达Red重组酶)的大肠杆菌菌株BW25113中,获得了可用于BmNPV基因打靶的菌株BW25113-Bac。设计一对长63bp的引物(5′端为orf60基因的左右同源臂,长45bp;3′端长18bp,为氯霉素抗性基因(cat)的首尾序列),以pKD3质粒(含cat)为模板,PCR扩增携带orf60左右同源臂的cat,即打靶线性化片段。将该线性化片段电转入BW25113-Bac菌株,在Red重组酶的作用下,线性化片段与BmNPVbacmid中的orf60基因发生同源重组。设计3对特异引物,用PCR方法证明cat成功地替换了BmNPVorf60基因。重组bacmid DNA转染BmN细胞后,Western blot分析未检测到orf60基因的表达。     

蛋白修饰途径中结合酶在免疫应答中的功能

泛素化途径和SUMO化途径是真核生物细胞内两种很重要的蛋白修饰途径,结合酶为蛋白修饰途径中的第二个酶,对于靶蛋白的修饰具有十分重要的作用。近年来,在研究细胞遭受病原体入侵时产生的免疫应答中屡次鉴定出结合酶的参与。对于结合酶在免疫反应中的功能多样性从病毒和细菌引起的免疫应答两个方面,对泛素结合酶进行了总结,同时也介绍了SUMO结合酶在免疫反应中的研究进展。     

利用Red系统快速敲除家蚕核型多角体病毒orf60基因

用Red重组系统和最近构建的家蚕核型多角体病毒（BmNPV）bacmid在大肠杆菌BW25113中快速地敲除BmNPV orf60基因。从大肠杆菌BmDH10Bac中提取BmNPV bacmid,将其电转化到含有质粒pKD46（能表达Red重组酶）的大肠杆菌菌株BW25113中,获得了可用于BmNPV基因打靶的菌株BW25113-Bac。设计一对长63bp的引物（5′端为orf60基因的左右同源臂,长45bp;3′端长18bp,为氯霉素抗性基因（cat）的首尾序列）,以pKD3质粒（含cat）为模板,PCR扩增携带orf60左右同源臂的cat,即打靶线性化片段。将该线性化片段电转入BW25113-Bac菌株,在Red重组酶的作用下,线性化片段与BmNPV bacmid中的orf60基因发生同源重组。设计3对特异引物,用PCR方法证明cat成功地替换了BmNPV orf60基因。重组bacmid DNA转染BmN细胞后,Western blot分析未检测到orf60基因的表达。     

bHLH转录因子家族研究进展

bHLH转录因子在真核生物生长发育调控中具有重要作用, 它们组成了转录因子的一个大家族。已经有20种生物基因组中bHLH家族的成员得到鉴定, 其中动物17种、植物2种、酵母1种。动物bHLH因其调控基因表达的功能不同而被分成45个家族; 此外, 根据它们所作用DNA元件和自身结构特点又被分成6个组。A组包含22个家族, 主要调控神经细胞生成、肌细胞生成和中胚层形成; B组包含12个家族, 主要调控细胞增殖与分化、固醇代谢与脂肪细胞形成以及葡萄糖响应基因的表达; C组包含7个家族, 主要负责调控中线与气管发育和昼夜节律、激活环境毒素响应基因的转录; D组只有1个家族, 它与A组bHLH蛋白形成无活性的异源二聚体; E组有2个家族, 调控胚胎分节、体节形成与器官发生等; F组也只有1个家族, 调控头部发育、嗅觉神经元生成等。文章综述了bHLH转录因子家族分类、起源、功能方面的研究进展情况。     

家蚕核型多角体病毒orf25基因在病毒感染过程中 编码一个30kDa的晚期蛋白

首次对家蚕核型多角体orf25基因进行了描述.扩增Bm25基因,亚克隆到原核表达载体pGEX-4T-2,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达含有GST标签的融合蛋白.IPTG诱导后高效表达GST-Bm25融合蛋白.纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体.利用制备的抗GST-Bm25融合蛋白的多克隆抗体进行表达时相分析显示:24 h p.i.检测到30 kDa的蛋白条带.RT-PCR方法,在18-72 h p.i 检测到Bm25基因的转录本.结论:以上数据表明Bm25基因编码一晚期表达的30kDa蛋白.     

家蚕抗BmNPV品系与感性品系血淋巴液蛋白质组的差异分析

利用遗传学的原理, 通过杂交和回交的方法, 建立家蚕抗BmNPV、感BmNPV以及近等基因系模型, 利用2-D电泳和MALDI TOF/TOF MS质谱技术, 从蛋白质组水平上研究家蚕对BmNPV抵抗性。其结果是获得家蚕高抗NB, 高感306, 近等基因系BC8五龄起蚕血淋巴液蛋白质差异表达谱, 分别获得180、190、187个蛋白点, 其中80%的蛋白点集中在等电点5~9范围之内。从三块凝胶上共获得明显差异蛋白点12个, 由质谱鉴定出5种蛋白, 其中氨基酰化酶(Aminoacylase)仅出现在抗性品系NB、近等基因系图谱中, 感性品系没有出现, 初步推测是家蚕抗BmNPV特有蛋白, 这是首次报道结果。     

家蚕生殖细胞相关基因nanos的克隆表达及在胚胎发育中的表达模式

【目的】探讨nanos基因在家蚕Bombyx mori胚胎发育中的表达模式,为进一步研究该基因在家蚕胚胎发育中的功能奠定基础。【方法】根据本实验室提交到GenBank中家蚕nanos的cDNA序列(登录号EF647589)设计引物,扩增出了一条长684 bp的编码片段,对该片段进行了克隆和表达,亲和纯化表达的蛋白并免疫新西兰大白兔制备抗体。Western blot检测家蚕早期胚胎nanos的表达情况,荧光定量PCR检测nanos在整个家蚕胚胎发育中的表达情况。【结果】克隆并表达了一条长684 bp的编码片段,得到了分子量约33 kD的融合蛋白。用制备的抗血清对家蚕早期胚胎蛋白的Western blot检测表明,nanos在此阶段基本是恒定表达。荧光定量PCR结果显示刚产的卵中nanos的表达量最大,第2天开始急剧下降,此后到第10天表达量几乎没有变化。【结论】本实验克隆的nanos是家蚕中的一个同源物,该基因在家蚕胚胎发育中的表达模式与蜜蜂等有很大的不同,反映了昆虫生殖细胞形成机制的多样性。