鼠疫菌OxyR调控子蛋白对dps的转录调控机制

[目的]利用分子生物学实验研究鼠疫菌调控子OxyR对dps的转录调控机制.[方法]提取鼠疫菌野生株(WT)和oxyR突变株(ΔoxyR)的总RNA,采用引物延伸实验研究dps的转录起始位点,并根据产物的丰度判断OxyR对dps的调控关系.进一步采用实时定量RT-PCR的方法验证OxyR对dps的调控关系.PCR扩增dps的整个启动子区DNA序列,并纯化His-OxyR蛋白,通过凝胶阻滞实验(EMSA)验证OxyR对dps启动子区是否具有直接的相互作用.利用大肠杆菌OxyR识别基序,预测鼠疫菌OxyR对dps启动子区的结合位点,从而得出鼠疫菌OxyR对dps的转录调控机制.[结果]鼠疫菌dps有一个转录起始位点G(-40)(翻译起始位点为+1),其转录表达受OxyR的激活;体外实验及生物信息学预测结果表明OxyR能结合到dps启动子区-111到-78之间的碱基上.[结论]OxyR能直接结合到dps启动子区而激活其转录表达.     

副溶血弧菌毒力评价小鼠模型的建立与应用

目的建立用于评价副溶血弧菌毒力的小鼠模型,为研究副溶血弧菌的致病机制奠定基础。方法将适宜浓度的菌液经腹腔感染4～5周龄雌性BALB/c小鼠,观察小鼠的症状及死亡数。结果高盐(2%NaCl)条件下培养的强毒株RIMD2210633,经腹腔感染107CFU的菌量,小鼠存活率为20%～30%,而环境无毒株S251的小鼠存活率为100%。结论建立了评价副溶血弧菌毒力的实验小鼠模型,并应用于不同盐分浓度培养的强毒株与环境无毒株的毒力比较实验。     

肺炎克雷伯菌质粒p1512-KPC的测序及比较基因组学分析

【目的】对多重耐药的肺炎克雷伯菌1512中的质粒p1512-KPC进行测序及比较基因组学的分析。【方法】利用16S rRNA基因测序进行菌种鉴定,根据7对管家基因(gapA、infB、mdh、pgi、phoE、rpoB和tonB)对菌株进行多位点序列分型(Multilocus sequence typing,MLST)。利用PCR进行耐药基因的筛查,通过接合转移实验及电转化实验将质粒转入受体菌大肠杆菌EC600。采用改良Carba NP法检测细菌碳青霉烯酶的活性以及类型,使用VITEK2Compact全自动细菌鉴定及药敏分析仪检测菌株最小抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration,MIC)。最后通过高通量测序技术结合生物信息分析手段明确菌株1512及质粒p1512-KPC的耐药基因谱,并通过比较基因组方法对质粒p1512-KPC的基本结构、耐药基因遗传环境及移动元件等结构基因组学特征进行分析。【结果】菌株1512为产A类碳青霉烯酶的多重耐药肺炎克雷伯菌,MLST分型结果显示该菌为ST11型。经PCR筛查,菌株1512包含bla_(KPC-2)、dfrA1和sul1耐药基因,其中bla_(KPC-2)基因位于不可结合转移但电转成功的质粒p1512-KPC上。测序结果显示,质粒p1512-KPC长度为117.69 kb,同时包含IncFII型复制子和属于Rep_3家族但类型未知的复制子repB,并携带耐药基因bla_(KPC-2)、bla_(CTX-M-65)、bla_(TEM-1)及rmtB。其中bla_(KPC-2)、bla_(CTX-M-65)及bla_(TEM-1)分别存在于截短的Tn6296、Tn6367及截短的Tn2的基因环境中。【结论】携带bla_(KPC-2)、bla_(CTX-M-65)、bla_(TEM-1)及rmtB基因的质粒p1512-KPC介导了肺炎克雷伯菌1512对青霉素类、头孢菌素类、碳青霉烯类、单环β-内酰胺类及氨基糖苷类抗生素耐药,并能引起相应耐药基因的水平传播。此外,本研究还对IncFII型复制子和Rep_3家族复制子repB共存的质粒进行了比较基因组分析,为该类型质粒的多样性和进化提供了更深入的理解。     

H-NS蛋白对副溶血弧菌hcp1的转录调控

【目的】研究调控子H-NS对副溶血弧菌T6SS1结构蛋白基因hcp1的转录调控机制。【方法】利用Western blot检测Hcp1蛋白在野生株(WT)和hns基因敲除株(Δhns)中表达水平的差异。提取WT和Δhns的总RNA,采用实时定量RT-PCR的方法验证H-NS对hcp1的转录调控关系。进而采用引物延伸实验研究hcp1的转录起始位点,并根据产物的丰度判断H-NS对hcp1的调控关系。PCR扩增hcp1的整个启动子区DNA序列,并纯化His-H-NS蛋白,通过凝胶阻滞实验(EMSA)验证His-H-NS对hcp1启动子区是否具有直接的结合作用。【结果】Western blot和实时定量RT-PCR结果显示H-NS能抑制hcp1的表达;引物延伸结果显示hcp1只有一个转录起始位点T(–62)(翻译起始位点为+1),且其转录活性是H-NS和σ54依赖性的;EMSA实验表明H-NS对hcp1的启动子区具有直接的结合作用。【结论】H-NS能直接结合到hcp1启动子区而抑制其转录表达。     

不同遗传背景下QsvR调控副溶血弧菌基因表达的转录组分析

【背景】OpaR是副溶血弧菌群体感应系统的核心调控因子;QsvR是AraC家族转录调控因子,与OpaR之间具有相互调控作用;此外,QsvR对基因表达的调控作用受OpaR的影响,但是影响程度并未完全阐明。【目的】探究在野生株(wild-type,WT)和opaR基因突变株(ΔopaR)的遗传背景下QsvR的转录调控元,分析Opa R对QsvR基因表达调控的影响。【方法】分别以WT和ΔopaR为参照,采用Illumina HiSeq测序平台进行比较转录组学研究,分析生物膜形成条件下qsv R基因突变株(Δqsv R)和Δqsv RΔopaR的基因表达情况。【结果】在WT遗传背景下,QsvR共调控1735个基因的转录(调控元1),其中被激活的基因有855个,被抑制的基因有880个;在ΔopaR遗传背景下,QsvR共调控1 187个基因的转录(调控元2),其中被激活的基因有533个,被抑制的基因有654个。调控元1和调控元2之间共有517个重叠基因,且QsvR对绝大多数重叠基因的调控关系相反。基因属性分类(gene ontology, GO)数据库富集分析结果显示,调控元1和调控元2中分别有4...     

转Bt基因抗虫棉对棉铃虫拒食作用及其机理研究

转Bt基因抗虫棉对 3 ,4,5龄棉铃虫幼虫的抗性表现形式为拒食作用 ,且随幼虫龄期的增加拒食作用明显降低 ,其中对 5龄幼虫的拒食作用很低。取食Bt棉后 ,3 ,4,5龄棉铃虫幼虫中肠消化酶比活力均较对照有所减退 ,且随幼虫龄期的增加减退率明显降低 ,其中对 5龄幼虫减退率最低。由此 ,解释了Bt棉对 3龄及 3龄以上棉铃虫幼虫抗性表现形式、抗性随不同幼虫龄期的差异性 ,及其抗性差异性的消化机理。     

副溶血弧菌ToxR截短体蛋白的表达纯化及其DNA结合活性

【目的】利用大肠杆菌BL21λDE3表达系统,表达出有活性的副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)ToxR截短体蛋白,为进一步研究ToxR的转录调控机制奠定基础。【方法】以VP基因组DNA为模板,PCR扩增ToxR蛋白DNA结合结构域(ToxR-N)的DNA片段,并将其直接克隆入pET28a中,获得重组质粒;将重组质粒导入大肠杆菌BL21λDE3中,所得菌株经IPTG诱导后能表达出His-ToxR-N蛋白。利用限制级凝血酶切除His-ToxR-N中的His-标签,进而以VP的calR和VP1687为靶基因,通过体外的凝胶阻滞实验(EMSA)验证ToxR-N蛋白的DNA结合活性。分别构建克隆有calR和VP1687上游启动子区的LacZ重组质粒,并将重组质粒转入野生株(WT)和toxR突变株(ΔtoxR)中,通过测定β-半乳糖苷酶活性来比较两株重组菌中靶基因启动子活性,以验证ToxR对calR和VP1687的调控关系。【结果】成功表达出有活性的ToxR-N蛋白,该蛋白对calR启动子区具有结合活性。LacZ结果显示ToxR对calR的转录具有激活作用,而对VP1687的转录具有抑制作用。【结论】所表达的ToxR-N可用于后续的转录调控机制研究;ToxR通过直接激活calR的转录表达,而间接抑制T3SS1相关基因的表达。     

利用优化的5′-RACE实验定位副溶血弧菌基因的转录起始位点

目的:优化5′-cDNA末端快速扩增(5′-RACE)实验平台,用于定位副溶血弧菌(VP)基因的转录起始位点。方法:提取VP的总RNA,用rDNaseⅠ消化去除可能污染的基因组DNA;利用T4 RNA连接酶将已知序列的寡核苷酸片段连接至RNA的5′端,进而将其逆转录成cDNA;以cDNA为模板,采用巢式PCR技术扩增目的基因DNA片段,并将其直接克隆入T载体;最后通过测序比对的方法确定靶基因的转录起始位点。利用引物延伸实验进一步研究VPA1027的转录起始位点,以检验5′-RACE实验结果的可靠性。结果:5′-RACE实验结果表明,VPA1027、scrG、scrA、cpsA及VPA0198的转录起始位点分别为G(-103)、G(-70)、T(-205)、C(-129)和G(-238)(翻译起始位点为+1);引物延伸结果显示,VPA1027的转录起始位点也为G(-103)。结论:优化后的5′-RACE实验可以精确定位VP基因的转录起始位点。     

鼠疫耶尔森氏菌质粒上重要毒力相关基因的克隆与表达

鼠疫耶尔森氏菌含有3种质粒pMT1、pPCP1和pCD1,这3种质粒编码鼠疫耶尔森氏菌的多种重要毒力因子。首先通过生物信息学技术选定了18种可能重要的毒力相关基因作为拟克隆和表达的目的基因。通过：PCR技术、TA克隆技术、双酶切技术获得目的片段。这些目的片段再分别克隆入原核表达载体pET32a中,构建了一系列重组表达质粒,其中12个重要的毒力相关基因在原核表达载体pET32a中有稳定的高效表达,表达量占细菌总蛋白的20％～40％。实验结果为进一步研究质粒编码的毒力因子的结构与功能,及其作为新型疫苗选择的可能性奠定了基础。     

PCR-RAPD分子生物学技术及其在植物抗病性研究中的应用

PCR—RAPD技术是一种高效的基因组DNA多态性分析技术,能够在对生物细胞或组织中DNA遗传多样性、亲缘关系及系统进化分子标记检测的同时进行基因定位与遗传作图。本综述了PCR—RAPD技术的基本原理和应用范围,以及近年来在植物抗感病品种(品系)间亲缘远近关系分析、植物抗病性遗传基因的DNA分子标记与检测、植物抗病基因的标记和定位、植物抗病基因的分离与克隆、植物抗病育种的分子标记辅助选择与检测等植物抗病性分子机制研究方面的应用,并对该技术所存在的问题及应用前景进行了探讨。